对硫磷酶联免疫吸附分析方法的建立和评价

通过制备对硫磷的多克隆抗体,建立了对硫磷的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(icELISA)。通过活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,获得免疫抗原和包被抗原。使用对硫磷抗血清,经优化条件参数建立了对硫磷的icELISA分析方法。该方法检测线性范围为3.39～533.05ng/mL,最低检测限为0.90ng/mL,对蔬菜样品和水样品的平均添加回收率为75.6%～127.4%,能用于实际样品中对硫磷的检测。     

孔雀石绿人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

通过研究孔雀石绿(MG)抗原的合成和多克隆抗体的制备,探索研究食品中孔雀石绿残留的检测方法。本实验先合成含有羧基的孔雀石绿半抗原(CMG),并用液-质联用法进行分析鉴定。半抗原经重氮化法处理后分别偶联两种载体蛋白BSA和OVA,并通过紫外分光光度法进行鉴定。与CMG标准品和两种载体蛋白的紫外吸收光谱相比,偶联物的吸收峰发生了明显的偏移,计算得免疫原的偶联比为10.6:1,说明偶联成功。通过免疫制备多克隆抗体,并通过间接ELISA法对CMG抗血清的效价进行检测,并进一步检测抗体的特异性,两只兔子的IC50值分别为8.1ng/mL和4.6ng/mL。     

沙丁胺醇直接酶联免疫快速检测的方法

沙丁胺醇与瘦肉精同属于禁用的饲料添加剂,可以在动物体内大量残留,人体过量摄入会引起中毒反应。为了建立沙丁胺醇的快速检测方法,从硫酸沙丁胺醇出发制备了半抗原沙丁胺醇丁二酸衍生物,用混合酸酐法将半抗原与载体蛋白-钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联作为免疫抗原制备了沙丁胺醇的多克隆抗体,建立了沙丁胺醇直接竞争酶联免疫检测方法,该方法抗体最佳包被抗体量为1μg/孔,酶标抗原稀释比例为1∶16000,掩蔽剂采用脱脂奶粉。所建立的方法具有很高的灵敏度和特异性I,C50为0.90ng/mLI,C15达到了0.05ng/mL,远低于国家残留限量标准,与沙丁胺醇的结构类似物基本没有交叉反应。     

毒死蜱单克隆抗体制备及icELISA检测方法优化

目的制备毒死蜱单克隆抗体,建立icELISA(间接竞争酶联免疫吸附方法)检测方法并对其进行优化。方法以毒死蜱为基础物质,制备半抗原CPF-H1和CPF-H2,偶联蛋白制备人工抗原,进而通过免疫、细胞融合、筛选得到特异性的单克隆抗体,建立毒死蜱的icELISA检测方法,并对其分析条件进行优化。结果质谱鉴定结果表明毒死蜱半抗原制备成功;半抗原偶联蛋白,紫外全波长扫描鉴定人工抗原制备成功;免疫动物、细胞融合并制备单克隆抗体;建立了icELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:PBST为标准品稀释液,包被抗原最佳稀释倍数为1:1000,抗体最佳稀释倍数为1:1000,一抗反应最佳时间为40 min,二抗反应最佳时间为30 min,制得毒死蜱标准曲线,毒死蜱对抗体的IC_(50)为73-25 ng/mL,线性范围IC_(20)~IC_(80)为32.52~260ng/mL,LOD为19.34 ng/mL。结论本研究为毒死蜱快速检测技术奠定了理论基础,对保障人们的身体健康具有重要的意义。     

环丙沙星衍生物的制备及其抗体特异性研究

本文研究了环丙沙星(CPLX)羧基衍生物及其抗体的制备,并对该衍生物抗体的特异性进行了测定。将环丙沙星与3-溴丙酸反应,生成环丙沙星的羧基衍生物(CPLX-COOH),通过制备液相进行纯化,用红外光谱(IR)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)与核磁共振法(NMR)进行鉴定;将环丙沙星衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)进行偶联,分别制备免疫抗原(CPLX-COOH-BSA)和包被抗原(CPLX-COOH-OVA),并用紫外光谱法进行鉴定。用免疫抗原免疫BALB/c小鼠,制备环丙沙星衍生物多克隆抗体。通过ELISA方阵滴定法,确定包被抗原的最佳包被浓度和抗体最佳稀释度,建立了CPLX-COOH间接竞争ELISA检测方法,其半抑制浓度IC50为228.56 ng/mL,最低检出限(LOD)为25.527 ng/mL,该抗体具有广谱特异性,可与多种氟喹诺酮类药物发生交叉反应,可进行氟喹诺酮类药物残留的多元检测。     

间接竞争酶联免疫法测定鱼体中的亚甲基蓝

目的 本实验旨在建立快速检测鱼体中亚甲基蓝的间接竞争酶联免疫分析方法。方法 以BSA载体蛋白,以天青C(Azure C)为半抗原,利用戊二醛法合成免疫原Azure C-BSA,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。通过对包被浓度、抗体浓度和二抗浓度等一系列实验条件的优化,建立检测鱼体中亚甲基蓝的间接竞争酶联免疫吸附方法(ic-ELISA)。结果 获得的多克隆抗体特异性强、灵敏度高,在5 -500 ng/mL范围内,线性良好,线性回归方程为y=0.3658x-0.1867 (R²=0.98),IC50为75.4 ng/mL,检测限为8.3 ng/mL,样品添加回收率为77.2%-79.3%,RSD为5.3 %-8.1 %。结论 该方法灵敏度高、特异性强,可用于鱼体中亚甲基蓝的快速检测。     

玉米赤霉烯酮多克隆抗体的制备及特性分析

合成玉米赤霉烯酮半抗原,应用液相色谱-质谱联用法进行鉴定,并采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白OVA或BSA偶联,分别作为免疫原或包被原,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和紫外扫描法鉴定偶联效果,免疫3只BALB/c小鼠,制备玉米赤霉烯酮多克隆抗体。结果表明:抗血清效价最高达1∶32 000,以此多抗建立的玉米赤霉烯酮间接竞争标准曲线IC50为39.8ng/mL,IC10为0.71ng/mL,多抗与玉米赤霉烯酮类似物β-zearalenol、zear-alanone、α-zearalanol、β-zearalanol交叉反应率分别为4.80%,3.07%,0.96%,0.09%。说明试验成功制备了玉米赤霉烯酮人工抗原及高特异性多克隆抗体。     

雌二醇间接竞争酶联免疫吸附方法的建立

建立食品中雌二醇免疫分析方法。将雌二醇进行结构改造合成半抗原并经过核磁氢谱和红外光谱验证,再采用活泼酯法与载体BSA和OVA偶联制备人工抗原,免疫兔子制备多克隆抗体,经过反应条件优化建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法。结果表明：IC50为3.9ng/mL,检测限为0.3ng/mL,交叉反应率均小于1.21%。检测方法具有高灵敏度和特异性,可应用于食品中雌二醇检测试剂盒的研制。     

氯丙嗪抗体制备与酶联免疫吸附测定方法的建立

本研究针对动物性食品中违禁药物氯丙嗪残留问题,建立了针对氯丙嗪的酶联免疫吸附测定方法。首次通过以氯丙嗪为原料,先去甲基化合成N-甲基氯丙嗪,再与丙烯酸叔丁酯反应及水解等步骤成功合成了氯丙嗪半抗原（CPZ-H）。半抗原CPZ-H分别与OVA和BSA通过活泼酯法偶联合成包被原与免疫原,采用免疫原CPZ-H-BSA免疫新西兰大白兔成功制备了特异性的抗氯丙嗪的多克隆抗体。基于该抗体建立了快速测定氯丙嗪的间接竞争酶联免疫吸附测定方法（ic-ELISA）。通过优化ic-ELISA方法的最佳工作条件,确定包被原和抗体稀释倍数均为1:8000时效果最好,此时标准曲线的IC50为1.1 ng/mL,线性范围为：0.13 ng/mL~8.8 ng/mL。制备的抗氯丙嗪的多克隆抗体与其它氯丙嗪类似物无交叉反应,特异性好。本研究为今后高特异性氯丙嗪快速检测试剂盒的制备提供依据。     

孔雀石绿多克隆抗体的制备与筛选

设计并成功合成了三种孔雀石绿半抗原,所有半抗原均采用活化酯法分别与血匙兰蛋白(KLH)偶联制备成免疫抗原,与卵清蛋白(OVA)偶联制备成包被抗原。利用所制备的三种免疫原免疫新西兰大耳白兔都获得了高效价的抗孔雀石绿抗体,并将每一种抗体都与三种包被抗原进行组合配对,通过间接竞争酶联免疫吸附检测(ELISA)方法筛选出最佳的抗体-包被抗原组合,筛选出的抗体采用Sepharose FF-Protein A亲和层析柱纯化,采用间接ELISA法测定效价及鉴定特异性。经测定筛选出的抗体效价达到1:12000,IC50值为0.65 ng/mL,交叉反应表明该抗体有较好的特异性,与结构类似物结晶紫的交叉反应率为18.73%,与隐性孔雀石绿及隐性结晶紫的交叉反应率低于10%。本研究为建立快速检测食品中孔雀石绿残留的免疫分析方法奠定了基础。     

除草剂异丙甲草胺特异性抗体制备及免疫检测方法的建立

为检测食品中的异丙甲草胺农药残留,降低其对人体可能造成的危害,本文建立了基于抗体的酶联免疫分析方法。首先以除草剂异丙甲草胺、3-巯基丙酸为原料合成半抗原,经由氢核磁共振和质谱方法鉴定后,通过碳二亚胺（EDC）法将半抗原与载体蛋白偶联制备异丙甲草胺人工抗原,免疫新西兰大白兔获取抗体,通过棋盘滴定确定抗原抗体最佳稀释倍数,ELISA反应的抗体稀释液为PBS（1% PEG 6000）,药物稀释液为PBS（10%甲醇）,在此基础上建立间接竞争ELISA标曲,其IC50为14.64 ng/mL,检测限（limit of detection,LOD）为0.8 ng/mL,线性检测范围IC20~IC80为1.51~141.92 ng/mL。与14种结构类似物进行交叉反应,交叉反应率低于3%。向环境水样中添加异丙甲草胺,回收率为86.60%~102.16%,变异系数（RSD）为7.05%~13.30%。此抗体灵敏度高特异性好,可用于食品和环境中异丙甲草胺的监测。     

糖皮质激素广谱特异性单克隆抗体的制备及其ic-ELISA方法的建立

将氢化可的松半抗原HYD通过活化脂法与钥孔戚血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶联获得氢化可的松完整抗原KLH-HYD,并对小鼠肌肉注射此抗原,使小鼠免疫;通过杂交瘤技术获得1 株能够稳定分泌氢化可的松的单克隆抗体细胞株HYD-C1,并通过腹水制备大量抗体。将氢化可的松半抗原HYD和地塞米松半抗原DEX通过活化脂法分别与卵清蛋白（ovalbumin,OVA）偶联作为包被原,建立糖皮质激素的间接竞争酶联免疫吸附检测（indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA）方法。结果：在同源包被情况下氢化可的松灵敏度为1.63 ng/mL,异源包被情况下灵敏度为0.24 ng/mL;在交叉抑制实验中,异源策略中的各糖皮质激素灵敏度均高于同源策略中的结果,异源策略条件下很好地覆盖了本研究中所检测的糖皮质激素,使该抗体具备良好的广谱特异性。在异源策略添加回收实验中平均添加回收率在77.5%～111.3%之间,落在合理范围内,满足检测需求。结论：成功制备出氢化可的松单克隆抗体,建立了同源和异源策略糖皮质激素检测方法,结果发现异源策略中糖皮质激素的灵敏度高于同源策略,并使该方法具有更好的广谱特异性。     

氟乐灵抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立

该研究针对农(水)产品中氟乐灵农药残留的问题,建立了间接竞争酶联免疫分析方法,快速检测氟乐灵农药.利用3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯与仲胺侧链氨基反应合成半抗原2C,采用碳二亚胺法将半抗原2C与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联合成完全抗原.通过免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体PcAb-2C,基于间接竞争酶联免疫分析方法原理对...     

基于异源包被的 曲安奈德竞争酶联免疫检测方法

为监控曲安奈德的滥用情况,本研究建立了曲安奈德竞争酶联免疫检测方法。将曲安奈德(Triamcinolone acetonide,TCA)半抗原通过活泼酯法与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联获得曲安奈德完整抗原TCA-KLH;通过免疫小鼠、细胞融合及筛选获得一株能够稳定分泌抗曲安奈德的单克隆抗体细胞株,制备并纯化了腹水抗体。将TCA和地塞米松(Dexamethasone,DEX)半抗原通过活泼酯法分别与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联作为包被原,建立曲安奈德同源及异源的间接竞争酶联免疫分析方法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)。在同源包被情况下,曲安奈德灵敏度为5.4 ng/mL,而DEX异源包下灵敏度为0.53 ng/mL。未观察该方法到对哈西奈德、布地奈德、安西奈德以外的其他糖皮质激素的交叉反应。在添加回收实验中,使用20%甲醇水溶液提取动物组织的添加回收率在75%~95%之间。该方法能有效应用于动物组织中曲安奈德的快速筛查。     

Development of Monoclonal Antibodies and Indirect Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for the Detection of Clenbuterol and Salbutamol in the Tissues and Products of Food-Producing Animals

To better monitor the residues of clenbuterol and salbutamol in edible tissues and products of animals treated with these compounds, a monoclonal antibody (mAb) against the β-agonists was prepared, and an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ic-ELISA) based on this antibody was also developed. The hapten of salbutamol was synthesized and conjugated to carrier proteins via different linkers. Female Balb/c mice were immunized with the hapten-protein conjugates to produce monoclonal antibodies using the standard fusion procedures. After fusion and four cloning cycles, eight hybridomas were isolated and of which one clone, 6E5, that has the isotype IgG1, was selected for the present study. The cross-reactivities of the mAb 6E5 towards salbutamol, clenbuterol, mabuterol, cimaterol, clenproperol, mapenterol, tuoloterol and terbutaline were determined as 104.5, 100, 100, 83.6, 71.9, 44.2, 6.3 and 2.3%, respectively. The limit of detection for salbutamol and clenbuterol in edible animal tissues was 0.21 and 0.57 μg kg^?1, respectively. The recoveries ranged from 55.4 to 122.0%, and the CVs were less than 19.6%. When used with spiked or incurred samples, or in a field trial, the established ic-ELISA has demonstrated a consistent performance in various biological matrices, suggesting this is a sensitive, accurate and low-cost analytical method.     

基于金纳米颗粒信号放大ELISA检测食品中恩诺沙星

以金纳米颗粒（gold nanoparticles,AuNPs）为信号放大载体,利用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的二抗为信号探针,建立一种基于AuNPs的信号放大酶联免疫检测方法（AuNPs signal amplification enzyme-linked immunosorbent assay,AuNPs-HRP-IgG ic-ELISA）,检测食品中恩诺沙星（enrofloxacin,ENR）。该方法对ENR的检测限（IC15）为5×10－4?ng/mL,半数抑制浓度（IC50）为0.24?ng/mL,检测范围为0.16～500?ng/mL,与建立的传统ELISA方法（IC50=8.76?ng/mL）相比,显著提高了检测灵敏度,并且该方法与环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星交叉反应率均小于0.1%,具有良好的特异性。该AuNPs-HRP-IgG?ic-ELISA方法的实用性得到了样品添加回收实验和商业化ELISA检测试剂盒的验证,其在牛奶样品中的加标回收率可达80.52%～102.66%,适用于实际牛奶样本中ENR的快速灵敏检测,也为建立其他食品危害物质的精准检测技术开发提供参考。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。