肉制品中牛源性成分多重实时荧光PCR检测 方法的建立及初步应用

目的建立肉制品中牛源性成分的荧光PCR检测方法。方法根据牛特异性线粒体DNA片段,设计合成两对引物,以生、熟牛肉及超市牛肉加工品为材料,建立肉制品中牛源性成分的多重实时荧光PCR检测方法,并用该法与国标法同时对市售的25份肉制品同时进行检测,通过对其他种类的肉源DNA进行扩增验证方法的特异性;对含有不同比例牛肉成分的DNA样本进行检测确定检出限。结果该方法可成功检测出肉制品中的牛源性成分。在25份肉制品检测中,与国标法检测结果一致。该法的特异性为100%,灵敏度检测线为1%。结论本研究成功建立牛源性肉制品的检测方法,该方法快速简便,且具有较高的特异性和灵敏度,可用于市售肉制品中牛源性成分的鉴定。     

肉制品中牛源性成分荧光定量聚合酶链式反应方法的建立与应用

为了能够快速准确检测出市场中掺假牛肉制品,采用Taq Man探针法,建立一种用于快速有效检测牛肉制品中牛源性成分的荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。选择Gen Bank中牛β-actin基因的保守序列,设计并合成特异性引物及Taq Man探针,以构建的p MD-18T-96-beef质粒为标准品,优化反应条件。结果表明:重组质粒标准品经PCR、测序和酶切鉴定正确,建立的标准曲线Ct值与模板拷贝数对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.98,斜率为-3.345,敏感度为46.1 copies/μL。特异性实验表明,用该方法检测猪肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等非牛肉制品结果均为阴性。批内重复实验变异系数均小于0.98%,批间重复实验变异系数均小于0.33%,表明该方法重复性良好。用建立的荧光定量PCR方法与SN/T 2051—2008《食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》同时对市场上40份牛肉加工品进行检测,结果显示,本方法检测有3份样品为牛源成分阴性,与SN/T 2051—2008方法检测结果相同。可见,本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于检测市场中肉类掺假的行为。     

实时荧光PCR定量检测肉制品中猪源性成分

为了准确可靠地对肉制品中猪源性成分进行定量检测,通过生物信息学方法筛选到猪细胞核单拷贝基因(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 2-like,CACA).以CACA基因为扩增靶标,设计了特异性引物、TaqMan探针,建立了基于实时荧光定量PCR...     

肉制品中牛源性成分Taqman荧光定量PCR检测法的建立

本实验根据牛线粒体差异序列设计特异性PCR引物和Taqman探针,并基于16S rDNA内参基因设计通用引物及Taqman探针,绘制并通过标准曲线确定样品中总DNA浓度以及牛源性成分DNA浓度,采用相对定量法测定肉制品中牛源性成分的质量分数。并通过特异性、灵敏度实验,及混合肉样回收率及市售肉制品检测,对本方法进行验证。结果表明,方法特异性强,可对牛肉DNA进行特异性扩增。最低检出限为10 pg/μL,具有较高的灵敏度。并根据回收实验可知,平均回收率为98.62%。可以为肉制品中牛肉含量的测定提供技术参考。     

肉制品中牛源性成分的PCR-RFLP检测

根据牛线粒体DNA特异性片段设计出引物,应用PCR-RFLP技术检测出7种生肉和4种加工肉制品中的牛源性成分,并根据线粒体中Cytb保守序列设立内源参照基因检测DNA提取效率。方法简便、快速、适合实验室常规物种检测。     

荧光定量PCR方法检测肉制品中鳄鱼源性成分

针对鳄鱼色素细胞b基因序列设计特异性引物,建立一种快速、特异、灵敏的鳄鱼源性成分检测方法。以常见羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鱼肉、虾肉为参考动物物种作特异性检测,并经检出限和灵敏度实验验证其可行性。结果表明：该方法能够有效对鳄鱼源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,鳄鱼组分DNA的检出限可达0.001 ng/μL,灵敏度可达0.01 %。通过加工肉制品的检测验证,该方法拥有特异性强、灵敏度高的特点,可以用于加工肉制品中鳄鱼源性成分的检测。     

肉制品中植源性转基因成分多重荧光定量PCR检测方法的建立

为改善产品品质,肉制品加工过程中常常添加植物源性成分,当前转基因农作物的商品化及其在市场上 的广泛流通导致肉制品中被带入植源性转基因成分的风险增加。以转基因植物中常涉及的调控元件CaMV 35S启 动子、NOS终止子以及标记基因NPTⅡ为检测目标,设计相应的引物和Taq man探针,利用载体pRⅠ 101-AN DNA 为模板,通过优化反应体系和反应参数,建立肉制品中植源性转基因成分的单重和多重荧光定量聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction,PCR）检测方法。通过比较分析,考察多重荧光定量PCR检测方法的灵敏性、重复性和准 确性,结果表明,多重荧光定量PCR检测方法灵敏度高、重复性好且与单重体系的检测结果具有很好的一致性。     

实时荧光PCR定量测定肉制品中羊源性成分

为准确定量肉制品中羊源性成分的含量,以羊单拷贝基因为扩增靶基因,设计合成羊源的引物、探针,制备羊源和脊椎动物通用基因的重组质粒以构建标准曲线,通过方程算出各自的拷贝数,根据拷贝数的比值计算样品中羊肉源成分占总肉成分的百分比含量,建立荧光定量PCR检测体系,并对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和灵敏度,最低检测到羊的DNA含量为0.02 ng/μL。对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测发现,羊肉掺入量为90%、50%时所得结果相对准确,相对标准偏差分别为5.69%和10.82%, 且不受外源物种的干扰。本试验建立的定量PCR方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现存在掺假现象。     

肉制品中鸭源性成分的实时荧光PCR检测

目的：建立基于实时荧光PCR技术的鸭源性成分的快速检测方法。方法：以鸭线粒体DNA序列为目的基因,设计并筛选了鸭源性特异性引物及探针,进行荧光定量PCR扩增,建立鸭源性成分检测方法。通过特异性、灵敏性、及盲样检测试验,对该体系进行验证。结果：该方法能够快速有效的检测鸭源性成分,具有较强的特异性及灵敏性,灵敏度约为0．01％（质量分数）;通过市售盲样肉制品的检测,表明该体系可用于定性检测加工肉制品中的鸭源性成分。结论：该方法特异性强,灵敏度高,可用于对肉制品中鸭源性成分的掺假鉴别。     

荧光定量PCR方法鉴别肉制品中羊源性成分

根据羊线粒体DNA细胞色素b基因序列,设计特异性引物和Taqman探针。通过反应条件的优化筛选,构建标准曲线,建立灵敏、可靠的肉制品中羊源性成分的实时荧光PCR鉴别方法。结果表明,所设计的引物可有效地进行肉制品中羊肉成分的鉴别,特异性强,灵敏度高达16pg/μL;标准曲线扩增效率达98.561%,R2=1,符合《实时荧光定量国际化标准-MIQE指南》要求;本研究建立的方法检测结果与国标GB/T 20190-2006方法结果符合率达100%,且不需电泳、酶切和测序等步骤。通过对市售肉制品样本的鉴别验证了方法的实用价值,为肉制品质量的有效控制提供了新的途径。      

微滴数字PCR法对肉制品中牛源和猪源成分的定量分析

为准确检测肉及肉制品中肉源成分的含量,实验基于微滴数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerasechain reaction,ddPCR）技术,建立了定量检测肉及肉制品中牛肉和猪肉含量的方法。由ddPCR结果可知,在一定范围内生鲜肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,并以DNA含量为中间值计算出DNA拷贝数（C）与生鲜肉质量之间的换算公式M牛=0.062C－0.943,M猪=0.045C－1.72。应用建立的数字ddPCR方法对已知目标肉种含量的混合肉样进行检测,结果表明测量值和真实值基本一致,且不受外源物种的干扰。通过对市售样品的检测,能够准确检测出不同样品中牛肉和猪肉的含量,并发现存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的ddPCR方法在肉及肉制品中牛肉和猪肉含量的定量检测方面具有较大的应用潜力,可为肉制品真伪鉴别日常检测提供有力的科学依据。     

微滴式数字PCR对肉制品中羊肉和猪肉定量分析

为了实现肉制品中羊肉和猪肉的量化研究,本文应用微滴式数字PCR对肉制品进行定量检测。通过在看家基因上设计单拷贝特异性引物,能更好的鉴别是人为因素的掺假还是在加工过程中无意的带入。根据dd PCR的结果显示,在一定范围肉质量和DNA的浓度,DNA浓度和DNA拷贝数(C)成现一定的线性关系。通过人为掺假及市售样品检测以验证此方法。以DNA浓度作为中间换算值,得到肉质量和DNA拷贝数之间的换算关系M_羊=0.12C-10.6 M_猪=0.07C+4。通过对已知掺假比例的肉样及市售样品进行检测,能够较好的得到掺假肉的质量。目前市场上存在一定的掺假现象且该检测方法具有一定市场应用前景,本文建立的微滴式数字PCR在羊肉和猪肉及其制品中的掺假检测具有较强的应用潜力,对目前混乱的肉制品掺假的市场监管提供了科学的依据。     

基于荧光定量PCR鉴定冷鲜肉制品中羊源性成分及其含量

建立一种快速、准确鉴定羊肉制品中羊源性成分并且量化羊肉成分含量的方法。以羊线粒体细胞色素b基因为靶基因,设计出具有特异性引物。选择真核生物核糖体16S rDNA为内参基因,采用实时荧光相对定量法。羊肉质量百分比的对数值与之对应的循环阈值差值ΔCt呈良好线性关系。标准曲线回归公式为y=-3.4057x-0.3112,R²=0.9916,扩增效率达E达96.62%。本试验中羊源性DNA检测限可达16 pg/μL,回收率在93.07%~106.20%。抽取8份市售羊肉制品进行检测,有3份含量低于50%。本试验中建立的实时荧光PCR检测方法操作方便、特异性强、灵敏度高,所得数据可靠,为肉制品羊源性成分检测提供了参考方法。     

GNM C7-8实时荧光PCR系统对掺假肉制品中多种动物源性成分的同时检测

应用GNM C7-8实时荧光PCR系统,同时快速检测掺假肉制品中多种动物源性成分。将牛肉粉、驴肉粉、鸵鸟肉粉和羊肉粉4组不同肉粉中分别混入猪肉粉、鸭肉粉、马肉粉、鸡肉粉和狐狸肉粉中的2~3种肉粉,制备人工模拟掺假肉制品。通过GNM C7-8实时荧光PCR和ABI7500荧光PCR方法,对上述四种掺假肉制品进行多种动物源性成分检测和比较。结果表明,GNM C7-8实时荧光PCR方法与ABI7500荧光PCR方法从掺假肉制品中检测猪、鸭、马、鸡和狐狸5种成分的循环数一致,分别是31、31、29、32和25,但基于八模块设计的GNM C7-8实时荧光PCR方法能同时检测四种掺假肉制品中不同动物源性成分,检测时间更短。因此,GNM C7-8实时荧光PCR系统的八个模块能够独立运行,互不干扰,无交叉污染,能够实现对掺假肉制品中多种动物源性成分的同时快速检测,为肉制品掺假检测提供强有力的方法支持。     

基于单拷贝核基因的数字PCR定量检测肉制品中羊源性成分

GeneBank搜索牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、鸡、鸭、鹅、火鸡、狗、猫、鼠、兔、貂等15种动物的单拷贝核基因组序列信息,应用生物信息学分析筛选15种动物共有的种间保守区域,设计一对可同时扩增15种动物源性DNA的内参基因引物和探针;同时分析筛选绵羊和山羊共有且和其余动物种内特异性区域,设计一对只能扩增羊源性DNA的特异性基因引物和探针。基于微滴数字PCR技术,引入内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立科学准确的肉制品中羊源性成分量化判定方法。结果表明,所建立方法具有良好的特异性和通用性,内参基因和羊种属特异性基因的最低检出限分别为32和26 copies/μL,模拟添加样品的正确度偏差均值为8.66%,符合数字PCR方法制定指南要求不得大于25%,说明量化判定方法结果具有较高的准确性。     

基于微滴式数字聚合酶链式反应技术的肉制品中鸭源性成分的定量检测

为实现肉制品中鸭源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)技术,以鸭生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,建立肉制品中鸭源性成分的定量检测方法.结果表明:所建立的ddPCR方法能特异性检测鸭源性...     

肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PCR检测研究

将荧光染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合,通过对PMA的曝光时间、浓度进行优化,确定PMA-PCR区别死活细胞的最佳条件,并制作活细胞定量标准曲线,建立肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PMA-PCR检测方法。结果表明：使插入死细胞DNA中的PMA活化并且光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min;不抑制沙门氏菌活细胞DNA扩增的最大PMA质量浓度为10μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小PMA质量浓度为4μg/mL。经PMA处理,含有不同比例的沙门氏菌热致死细胞和活细胞的混合液中活的沙门氏菌能够通过PCR被选择性的检测,最小检测限为20CFU/PCR。而且,经研究发现在20～2×105CFU/PCR范围内,电泳条带相对荧光强度与活细胞数的对数具有线性关系。采集30份肉及肉制品样品,利用PMA-PCR方法检测出两份生肉样品中存在沙门氏菌,经过6h的富集培养后的活菌浓度分别为2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。     

实时荧光定量PCR技术在食品微生物检测和研究中的应用

实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧：艺讯号强度来达到定量的目的,不仅实现了对核酸信息量的分析比较,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,近年来该技术开始作为食品微生物的研究手段。本文概述了实时荧光定量PCR技术的原理、优缺点及其在食品微生物检测中的应用与研究进展,并探讨了它的技术发展和应用前景。     

多重PCR技术检测肉品中致病菌的应用研究

快速检测和鉴别肉品中的致病菌是保障肉品质量安全,防止食源性疾病爆发的有效手段。多重PCR作为一种同时检测多种病原菌的PCR技术,具有高特异性,高灵敏度,低成本的特点。本文简要介绍了多重PCR原理,综述了PCR反应条件及检测肉品中致病菌的应用,并对其存在的问题做了简单阐述。