苹果酸-乳酸发酵过程酒酒球菌碳源代谢分析研究进展

葡萄酒苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)中碳源物质的利用及其产物、副产物的形成对葡萄酒感官品质有很大影响。其中,酒酒球菌参与的葡萄糖代谢、有机酸代谢及相关产物的形成和流向对葡萄酒MLF影响重大,决定着葡萄酒的最终品质。环境条件也是影响酒酒球菌生长的重要因素。苹果酸、柠檬酸和pH值三者在一定范围内相互作用,影响酒酒球菌生长。SO2会抑制酒酒球菌细胞ATP酶活性,高含量乙醇能增加细胞膜流动性,这些都会阻碍酒酒球菌生长,而溶解氧不仅不利于酒酒球菌生长,还会使醋酸菌等有害微生物大量繁殖,乙酸、双乙酰等不良产物含量上升,使葡萄酒败坏。本文就葡萄酒MLF过程中酒酒球菌的苹果酸代谢、柠檬酸代谢、糖代谢和乳酸、乙酸、双乙酰、乙偶姻等的产生途径及影响因素进行总结。     

葡萄酒中的酚类化合物及其对酒酒球菌生长的影响研究进展

本文综述了葡萄酒中酚类化合物的组成、特性及功能,并就有关酚类化合物对酒酒球菌生长的影响及酒酒球菌对酚类化合物的代谢进行了综述,以期为酒酒球菌苹果酸-乳酸发酵提供理论依据和指导。     

酒酒球菌基因功能研究方法进展

酒酒球菌(Oenococcus oeni)是葡萄酒苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation,MLF)的主要启动者与承担者,在葡萄酒酿造工业中具有重要地位。葡萄酒生境中的高酸度、高酒精度、低温等胁迫环境的存在,使得MLF的启动常常发生延迟甚至失败,因此,需要明确在酒酒球菌中发挥胁迫应答功能的关键基因及其作用机制。研究者利用组学技术发掘出大量与酒酒球菌特定表型或功能相关的基因,但相关研究进展缓慢,亟需确证这些基因与表型或功能的确切关系及其作用机制,为代谢调控或定向菌种改造增加MLF启动稳定性提供理论与技术支撑。文章归纳了组学技术和基因工程技术在酒酒球菌和植物乳杆菌中的应用进展,以期让研究者更加关注基因工程技术在酒酒球菌基因功能及其他相关的研究中,解决酒酒球菌基因功能研究的难题。     

酒酒球菌高密度培养条件的优化

酒酒球菌（Oenococcus oeni）主导的苹果酸-乳酸（MLF）发酵是优质葡萄酒生产的重要工艺环节,制备高活菌数的酒酒球菌发酵剂是保障该环节顺利进行的重要前提之一。研究发现,一定量的L-苹果酸可以有效促进酒酒球菌的生长,并通过高密度培养条件优化提高酒酒球菌菌体密度。结果表明,通过正交试验得出的最佳高密度培养条件为初始pH值5.1、接种量3%、L-苹果酸添加量1 g/L。在此优化条件下,酒酒球菌ES-1的菌体密度较高,为（7.33±0.40）×109 CFU/mL;进一步结合化学中和法和半连续培养法,可使最终菌体密度达（1.67±0.11）×1010 CFU/mL,是对照组的11倍。该研究获得的高密度培养优化方案可为制备优质本土酒酒球菌发酵剂奠定基础。     

酒酒球菌在葡萄酒中的应用研究进展

酒酒球菌（Oenococcus oeni,O.oeni）是葡萄和葡萄酒中主要的乳酸菌种类,它是一种营养缺陷型细菌,能够在葡萄酒恶劣条件下生存,在葡萄酒苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation,MLF）中担任主要角色,是葡萄酒最终风味的塑造者。为了进一步提高酒酒球菌在葡萄酒酿造工业中的应用,该文从酒酒球菌菌株分离筛选和鉴定,及其对葡萄酒酿造的有益作用,葡萄酒酿造过程对酒酒球菌的影响以及酒酒球菌在分子生物学方面的研究进展进行归纳和展望。     

酒酒球菌抗酒精基因RAPD标记的研究

以抗酒精酒酒球菌和酒精敏性酒酒球菌为材料,提取基因组DNA构建抗性与敏性基因池,对RAPD-PCR反应体系进行优化,利用RAPD分子标记技术对45条随机引物进行筛选。结果引物S90在750bp附近扩增出了差异条带,且重复性好,这表明S90 750是与酒酒球菌抗酒精基因相连锁的RAPD标记。     

酒酒球菌（Oenococcus oeni）相关生物组学研究进展

酒酒球菌（Oenococcus oeni）是触发葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的主要微生物,而苹果酸-乳酸发酵有利于提高葡萄酒品质,为了进一步提高酒酒球菌在葡萄酒酿造工业中的应用,通过各种生物组学方法来探究酒酒球菌的生物调节和代谢体系是必要的。本文对不同生物组学的研究手段进行汇总,并对其在酒酒球菌相关研究中的应用进行归纳和展望。     

酒酒球菌31MBR的β-D-葡萄糖苷酶活性

以对-硝苯-β-葡萄糖苷为底物,采用分光光度法对酒酒球菌31MBR的β-D-葡萄糖苷酶活性进行了初步研究。结果表明:酒酒球菌31MBR具有很高的β-D-葡萄糖苷酶活性,该酶为胞内酶,且主要为可溶性酶,酶活在对数生长中期最高且随着生长时间的延长呈下降趋势。β-D-葡萄糖苷酶为结构酶,但在纤维二糖和熊果苷的诱导下酶活均有不同程度的提高。酒酒球菌31MBR具有β-D-葡萄糖苷酶活性对增加葡萄酒香气和提高葡萄酒品质具有重要意义。     

宁夏酿酒产区酒酒球菌的快速鉴定及其PCR体系的优化

运用基于酒酒球菌16SrRNA高度保守序列设计的特异引物,通过对实验室保存优良酒酒球菌菌株的扩增验证,实现了对筛选自宁夏产区的未知苹果酸乳酸细菌的快速、可靠鉴定。通过对影响特异引物PCR反应体系的主要因素进行优化,建立了适合于实验室的特异引物扩增反应体系。结果表明:实验室保存酒酒球菌菌株均能扩增出唯一的、清晰的、大约995bp的条带,未知菌株通过扩增证明均为酒酒球菌;建立的特异引物扩增体系为:50μL的反应总体积,2.5UTaq酶、200μmol/LdNTP、0.2μmol/L上/下游引物、2.0mmol/LMg2+、DNA模板40ng。     

酒酒球菌arcABC基因簇的检测

采用PCR技术和气相色谱-质谱联用方法对西北农林科技大学葡萄酒学院保藏的50株酒酒球菌的arcABC基因簇进行检测,以确定其产生氨基甲酸乙酯的特性。结果显示：所有菌株均含有arcA、arcB和arcC基因,即arcABC基因簇;在添加精氨酸的模拟酒培养基中培养酒酒球菌30d后,通过气相色谱-质谱联用方法能够检测出微量的氨基甲酸乙酯;说明这50株酒酒球菌都具有产生氨基甲酸乙酯的能力。     

耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸合酶基因的差异

目的:研究筛选得到的野生耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因(cfa)的差异,探索酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因与酒酒球菌耐酸性的相关性。方法:35株野生酒酒球菌中,利用酸胁迫环境筛选耐酸能力最强的菌株,并与野生酸敏菌SX-1b及实验室离子注入诱变的耐酸、酸敏突变菌a3、b2共同进行环丙烷脂肪酸基因cfa的克隆、测序和比对;选择存在氨基酸突变的野生耐酸酒酒球菌及野生酸敏菌株的cfa基因在植物乳杆菌ATCC33222中进行外源表达,从而验证耐酸菌株cfa基因与耐酸能力的相关性。结果:(1)筛选出野生型耐酸酒酒球菌CS-7b和ME-5b,确定其耐酸生长极限为p H 2.6;(2)对野生菌与诱变菌的cfa基因进行测序比对发现,耐酸菌株的野生型和诱变型的序列相同,较酒酒球菌PSU-1发生3处碱基突变,而酸敏菌野生型、诱变型的序列则与酒酒球菌PSU-1一致;(3)将SX-1b与CS-7b的cfa基因在植物乳杆菌中表达,构建重组载体pMG36ecfa1和pMG36e-cfa2,并得到对应重组菌L1和L2;(4)在pH 3.6培养基中培养,重组菌L1和L2的生长情况明显优于含空载体的植物乳杆菌L0,且L2的生长优于L1。而在p H 3.4培养基中培养,L0没有生长迹象,只有重组菌L1和L2正常生长,cfa基因的导入突破了植物乳杆菌宿主菌的生长极限。结论:酒酒球菌cfa基因及基因间存在的稳定差异与菌株耐酸表型具有一定相关性。     

酒酒球菌抗酸相关基因RAPD标记的筛选

对影响RAPD 反应体系的主要因素进行优化,建立适合本实验室的RAPD 反应体系。在此基础上以33 株抗酸性酒酒球菌和9 株酸敏性菌株为试材,采用BSA 法和RAPD 技术,通过对45 个随机引物的筛选以及在单菌株中的筛选验证,最终获得与酒酒球菌抗酸性状相关的3 个RAPD 标记：S40-1400、S333-2500、S333-650。     

分子生物学技术在酒类酒球菌分类鉴定方面的应用

酒类酒球菌(Oenococcus oeni)是葡萄酒进行苹果酸乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)的主要菌群,对其进行快速、高效的分离鉴定非常重要,该文针对不同分子生物学技术在筛选优良酒球菌的原理及应用进行了分析,同时对其前景进行了展望。     

酒酒球菌(Oenococcus oeni)产胞外聚合物培养基的优化及其抗冷冻干燥性能评价

为了研究酒酒球菌(Oenococcus oeni)产胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)在冷冻干燥过程中的保护性能,通过优化培养基提高EPS产量,并通过EPS对细菌冷冻干燥存活率的影响以及观察冷冻干燥过程中酒酒球菌内部及外表面的变化,评价其抗冷冻干燥的性能。正交试验优化可得,在初始pH值4. 8、蛋白胨含量20 g/L、葡萄糖含量15 g/L的条件下,能产119. 7 mg/100 mL酒酒球菌EPS。EPS作为冷冻干燥保护剂时细菌冷冻干燥后的存活率为70. 97%,高于其他常规保护剂,扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)的图像表明添加冷冻干燥保护剂的实验组细胞形态更加完整,说明EPS有明显的冷冻干燥保护作用。该研究初步探究了酒酒球菌EPS冷冻干燥保护的机制,并为EPS在冷冻干燥保护剂中的应用提供理论基础。     

酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶研究进展

酒类酒球菌（Oenococcus oeni）是葡萄酒苹果酸乳酸发酵（MLF）中的主要微生物,糖苷物质是葡萄酒中的重要香气前体物,β-葡萄糖苷酶是降解糖苷物质的关键酶。酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶对增加葡萄酒香气,提升葡萄酒整体品质具有重要作用。该文介绍了β-葡萄糖苷酶的定义、分类、作用机制和测定方法,阐述了酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶活,探讨了pH值、发酵温度、乙醇浓度、糖含量和二氧化硫含量对酶活的影响,在分子生物学水平上研究了酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶基因,并对酒类酒球菌葡萄糖苷酶未来的研究热点和研究方向进行了展望。这对深入认识葡萄酒生物增香机理和提高葡萄酒整体品质具有重要意义。     

酒酒球菌计数方法研究

以酒酒球菌为试验材料,分别用平板计数法、浊度计法、分光光度计法进行计数,所得的细胞数分别与对应的NTU值、OD值建立回归方程,方程分别为y=(0.0913 3.0075x)×107;y=(73.561x-4.8994)×107.结果显示,两个方程均有极显著的直线回归关系(P＜0.01),但前者的回归系数大于后者.因此,在酒酒球菌计数时最好用浊度计法代替平板计数法.     

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与耐酸胁迫能力的相关性分析

目的:β-葡萄糖苷酶是葡萄酒中结合态香气物质释放的关键酶,但其活性受诸多因素的影响。本研究旨在从酒酒球菌自身耐酸能力的视角去分析评估菌株糖苷酶活性,探索酸胁迫下不同耐酸表型酒酒球菌与其β-葡萄糖苷酶活性之间存在的相关性关系。方法:结合利用离子注入诱变与胁迫环境筛选的方式,获得耐酸(p H 3.0)、酸敏(p H 9.0)突变酒酒球菌菌株,对其β-葡萄糖苷酶的活力进行测定,并筛选3组酸胁迫下表型差异大的β-葡萄糖苷酶基因送样测序。结果:耐酸突变酒酒球菌的β-葡萄糖苷酶酶活力是出发菌株的2~4倍,是相应酸敏突变株的2~7倍。测序结果显示,除菌株a3的β-葡萄糖苷酶基因在108位(G置换成C)和1 232(A置换成T)位处发生了突变外,其余菌株β-葡萄糖苷酶的基因均未发生改变。结论:酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与菌株酸胁迫能力显著相关(P0.05)。耐酸胁迫能力越强的菌株,β-葡萄糖苷酶活性越高。     

酒类酒球菌分离培养基研究

研究了9种乳酸菌培养基对酒类酒球菌的分离培养效果。结果表明，ATB，改良MRS培养基对酒类球菌的相对鉴别力（ROF值）最高；在以上2种培养基中添加50mg/L放线菌酮能有效地报制酵母菌的生长，可以用于酒类酒球菌分离。     

酒酒球菌在青梅汁中的生长及苹果酸乳酸发酵特性的研究

以青梅汁为原料,利用酒酒球菌的苹果酸-乳酸发酵(MLF)对青梅汁进行生物降酸的研究。结果表明:接种量为2.0×108CFU/mL,青梅汁的pH≥3.4时,MLF能正常进行,并使样品的酸度降低61.35%以上;接种量为2.6×107CFU/mL时,青梅汁的pH为3.6才能触发MLF,样品的酸度降低了77.60%;接种量为2.3×108CFU/mL,在pH3.6和4.0的青梅汁中,添加1.0g/100g的葡萄糖的样品,与不添加葡萄糖的样品相比,其酸度分别降低了27.04%和34.63%;在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系中,酒酒球菌使体系酸度降低了26.40%,证实酒酒球菌可利用柠檬酸作为碳源,进行MLF。     

酒酒球菌中生物胺相关基因的检测

酒酒球菌在葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中可通过脱羧基作用将氨基酸转化为生物胺.该研究采用PCR技术对27株酒酒球菌中与生物胺产生相关的基因-组氨酸脱羧酶基因、鸟氨酸脱羧酶基因、酪氨酸脱羧酶基因进行了检测,研究了这些菌株产生生物胺的特性.结果显示,所有菌株均不含有组氨酸脱羧酶基因、鸟氨酸脱羧酶基因、酪氨酸脱羧酶基因,不具有产生组胺、腐胺和酪胺的能力,因而具有较高的生物胺代谢安全性.