链霉亲和素的产生、纯化和鉴定

本文报道链霉亲和素(streptavidin.SA)的产生、纯化和主要特性鉴定。根据Streptomycesavidinii菌对碳、氮源的需求,配制成特定培养基,在28℃±1℃摇床培养S。avidinii 10天,SA产量为10～50mg/L。用2-亚氨基生物素琼脂糖凝胶层析纯化,每升培养上清平均可提取SA20～30mg。所得SA电泳出现2～3条区带,分子量为64562,等电点为6.0,紫外吸收扫描图谱与Sigma产品相似,SA活性平均为14.4 μg/ml,表明自制SA可供实际应用。     

生物素—链霉亲和素免疫组化法检测脊髓灰质炎病毒抗体

应用生物素—键霉亲和素免疫组化法检测自然人群和服苗儿童63份血清中三型脊灰抗体IgG，同时与中和试验对比，阴阳性总符合率均在92％以上，抗体液度呈正相关。组化法不仅敏感性高于中和法，而且较中和法简便、快速。故适用于脊灰抗体检测。     

核心链霉亲和素在毕赤酵母中的表达及纯化

目的构建核心链霉亲和素(core-streptavidin,CSA)酵母表达载体,表达、纯化CSA蛋白,并测定其活性。方法通过基因操作获得天然SA的核心活性区域基因片段,克隆至酵母表达载体p PIC9K,重组表达质粒p PIC9K-CSA经电击转化至毕赤酵母KM71感受态细胞中,甲醇诱导表达CSA蛋白。利用硫酸铵沉淀、2-亚氨基生物素琼脂糖凝胶亲和层析法纯化CSA蛋白,紫外光谱测定法检测CSA蛋白与生物素的结合活性。结果构建的CSA基因工程菌能有效表达目的蛋白,经硫酸铵沉淀、亲和层析两步法纯化后得到纯度约95%的CSA重组蛋白,其具有与生物素结合的活性,活性为13.6 U/mg。结论利用毕赤酵母表达系统能够有效分泌表达CSA蛋白,该重组蛋白具有良好的生物学活性,为CSA发酵产品的大规模纯化提供了依据。     

信号调节蛋白-α基因真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建信号调节蛋白-α(signal regulatory protein-α,SIRP-α)基因真核表达质粒,并于A549细胞中进行表达。方法提取Hep G2细胞总RNA,RT-PCR扩增SIRP-α基因片段,克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)-EGFP中,构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP。将重组表达质粒转染A549细胞,转染24 h后,荧光显微镜下观察转染情况;转染48 h后,RT-PCR检测SIRP-α基因的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测SIRP-α蛋白的表达。结果经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP构建正确;转染pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP的A549细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光;RT-PCR检测结果可见243 bp目的条带,Western blot检测显示SIRP-α存在。结论成功构建了真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP,并于A549细胞中有效表达,为进一步研究SIRP-α与肺癌的相关性奠定了基础。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆和表达

目的　扩增幽门杆菌热休克蛋白A 35 1bp的DNA片段 ,并将其克隆到pET - 2 8a(+ )质粒中高效表达。方法　用PCR方法扩增的片段经测序后 ,用GoldKey分析软件进行序列分析 ,应用pET - 2 8a(+ )系统在受体菌BL2 1(DE3)pLysS中表达热休克蛋白。结果　该序列表达的蛋白与已报道的热休克蛋白A序列相似。重组菌株用IPTG诱导后 ,经SDS PAGE和薄层扫描分析 ,表达的外源蛋白的相对分子质量为 180 0 0 ,以包涵体的形式存在 ,表达产物占菌体总蛋白的 6 4%。结论　HspA是最有可能做为H .p疫苗中的候选抗原成分     

重组人白细胞介素-4融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达的影响因素

目的　提高人重组白细胞介素 4 (rhIL 4 )在大肠杆菌中的表达量。方法　研究rhIL 4的体外诱导条件 ,包括诱导时间、IPTG浓度、诱导温度、菌体密度对表达量的影响。结果　最佳表达条件是诱导时间为 4h ,诱导温度为 4 2℃ ,A6 0 0 为 0 7～ 1 0 ,而IPTG的浓度对表达量无显著影响。结论　诱导时间、诱导温度和菌体密度的优化能提高外源基因在大肠杆菌中的表达产量。     

生长抑素基因在大肠杆菌pThioHis表达系统中的克隆与表达

目的　在大肠杆菌表达系统中高效表达生长抑素 (SS)基因。方法　以天然SS的氨基酸和基因序列为标准 ,将大肠杆菌使用频率较低的密码子分别更换成了使用频率较高的密码子 ,在SS基因的两端加上了合适的酶切位点 ,头部 :KpnI和NcoI;尾部 :PstI(这一酶切位点可与NsiI的切口互补 )。克隆至pThioHisA质粒的KpnI/PstI酶切位点后 ,再克隆至pThioHisA质粒的KpnI/NsiI酶切位点 ,使SS基因分别位于多克隆位点的尾部和前部。结果　重组质粒经酶切鉴定和基因序列测定证明 ,基因完全正确 ,在大肠杆菌TOP10中均得到较好的表达 ,IPTG诱导后 4h表达量基本达到最高 (37℃ ) ;在A60 0 0 .4～ 1.5之间用IPTG诱导均可获得到较好的表达 ,但以 0 .6左右为最佳诱导时机 ;在LB、TB和 2YT培养基中表达量依次为 :TB >LB >2YT ;表达的SS融合蛋白基本为水溶性的 ,具有良好的SS抗原性和免疫原性。结论　为基因工程SS大肠杆菌疫苗的研制奠定了基础     

重组人成骨蛋白-1基因在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达

目的　研究重组人成骨蛋白 -1(rhOP -1)在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达。方法　利用RT -PCR技术 ,从正常胎儿肾组织总cDNA中扩增得到rhOP- 1成熟肽基因片段 ,再将rhOP- 1成熟肽基因克隆于原核融合表达载体pGEX- 4T- 2中 ,构建表达质粒pCCBC- OP- 1,并转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)中 ,在发酵过程中不添加任何诱导剂。表达产物经SDS -PAGE分析。结果　扩增的目的基因序列与文献报道一致。表达的目的蛋白相对分子质量为 14 0 0 0 ,表达量达到菌体蛋白的 4 0 %。结论　克隆了人OP -1成熟肽基因 ,并实现了rhOP- 1的非诱导高效表达。     

弓形虫亲环蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)基因。方法收集、纯化Rh株弓形虫速殖子,提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增TgCyP基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-TgCyP,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果测序结果与GenBank中登录的基因序列同源性为100%,重组表达质粒pET-28a-TgCyP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白的相对分子质量约为26000,表达量约占菌体总蛋白的40%,Western blot显示其能被鼠抗弓形虫免疫血清识别。结论已在E.coliBL21(DE3)中表达了Rh株TgCyP,其有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。     

人胰岛素样生长因子-1的融合表达及纯化

目的利用原核表达系统融合表达人胰岛素样生长因子-1(human insulin-like growth factor-1,hIGF-1),并进行纯化及鉴定。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对hIGF-1天然基因序列进行同义突变,并人工合成,PCR扩增后,克隆至pET48b(+)载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白Trx A-hIGF-1经Ni2+亲和层析进行纯化,纯化产物经肠激酶酶切后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET48b-Trx A-hIGF-1经菌落PCR及测序证实构建正确;表达融合蛋白相对分子质量约为26 000,表达量约为菌体总蛋白的40%,主要以可溶形式存在于菌体裂解上清中,可溶性蛋白占总目的蛋白的比例不低于90%,纯化后纯度不低于90%,蛋白浓度为0.5 mg/ml;纯化的Trx A-hIGF-1融合蛋白可被肠激酶切割为相对分子质量约为8 000的hIGF-1蛋白和18 000的Trx A蛋白,hIGF-1蛋白可与兔抗hIGF-1多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了hIGF-1融合蛋白,为其生物学活性的研究及规模化生产奠定了基础。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位基因工程菌的发酵

目的 研究幽门螺杆菌热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）基因工程菌的发酵工艺。方法 通过不同培 养基、不同葡萄糖浓度、不同溶氧条件、补料与非补料对幽门螺杆菌热休克蛋白Ａ亚单位基因工程菌的菌体生长与 外源蛋白表达量的影响的比较,确定其较为合适的培养条件。结果 多批实验证明,菌体单产可达４２ｇ／Ｌ,目的蛋 白的表达率为３８．５％。结论 此发酵工艺可以提高ＨｓｐＡ基因工程菌菌体的得率和目的蛋白的表达。     

IL-2与绿脓杆菌外毒素A嵌合蛋白的研究

目的获得ＩＬ－２绿脓杆菌外毒素Ａ嵌合蛋白,用于相关疾病的治疗。方法用ＰＣＲ方法扩增分 离ＩＬ－２和ＰＥＡ的基因,将ＩＬ－２基因的３’端与绿脓杆菌外毒素Ａ基因的５’端连接后克隆至ｐＢＶ２２０上,转化大肠杆菌 ＤＨ５ａ。挑取菌落培养,快速提取质粒进行酶切,并在温控条件下表达。结果经鉴定,获得重组质粒ｐＢＶ／ＩＬ－２／ ＰＥＡ。温控诱导表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,在５１ ０００处有蛋白表达带。以鼠抗人ＩＬ－２单克隆抗体经免疫印迹验 证,该表达蛋白为所设计的嵌合蛋白。结论本研究建立了一种制备ＩＬ－２／ＰＥＡ嵌合蛋白的方法,该方法也可用于 表达其他蛋白。     

裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体的构建及大肠杆菌菌影的制备

目的构建噬菌体裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体,制备高质量的大肠杆菌菌影。方法自行设计一对引物,PCR扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,将该基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建大肠杆菌菌影的表达载体pGEX-E。在E基因基础上与辅助基因葡萄球菌核酸酶A(SN)基因串联,并插入pGEX-6P-1载体,构建双基因串联高效表达载体pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,制备大肠杆菌菌影。结果裂解基因E单基因及串联基因已成功插入融合表达载体pGEX-6P-1,所构建的大肠杆菌菌影表达载体pGEX-E、pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,诱导后经透射电镜及活菌计数显示大肠杆菌已发生不同程度裂解,制成了大肠杆菌菌影。电镜下菌影形态完整,内容物已释放到胞外。结论已成功构建了噬菌体裂解基因E单基因及裂解基因和核酸酶基因串联基因表达载体,并制成了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗及佐剂形式奠定了基础。     

木瓜凝乳蛋白酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建木瓜凝乳蛋白酶(CP)的表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法从生番木瓜中提取mRNA后进行反转录,得到木瓜凝乳蛋白酶的cDNA,PCR产物克隆到pET22-b(+)载体中,重组质粒转化至大肠杆菌BL21,进行诱导表达及表达产物的检测。结果表达产物的SDS-PAGE显示单一条带,相对分子质量约为26000。Western blot表明表达产物可与抗木瓜凝乳蛋白酶特异性抗体结合。结论CP基因已成功在大肠杆菌中克隆表达,为进一步纯化和动物实验奠定了基础。     

产GL-7ACA酰化酶基因工程菌的高活性表达

实现了戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)酰化酶的组成型表达,并通过替换重组质粒启动子的RBS序列,在摇瓶培养条件下,使新构建的重组质粒pGEMKT-HPRfACY在大肠杆菌JM105中表达GL-7ACA酰化酶酶活达到0.44 U/mL,是替换前的2倍. 使用廉价的玉米浆作为培养基中氮源主要来源,使JM105/pGEMKT-HPRfACY菌株酶活提高到2.98 U/mL. 采用补料批式培养,利用流加营养物控制发酵中后期的pH值,在pH为7.5的条件下,酶活峰值达到6.37 U/mL. 该体系无需诱导,工艺操作过程简单,成本低廉.     

Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用

大肠杆菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势。     

人白细胞介素18的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的　在大肠杆菌中高效表达IL 18。方法　从人外周血中提取RNA ,用RT -PCR方法得到IL 18的cDNA ,双酶切将其插入pET 2 3(b) + 载体中 ,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性菌落 ,提取质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达。结果　所获得人IL 18克隆 ,经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS -PAGE显示在相对分子质量 2 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的分子量一致。结论　已成功获得了人IL 18克隆并在大肠杆菌中表达     

用乳糖作为诱导剂进行重组蛋白的表达

目的研究用乳糖替代IPTG作为诱导剂进行重组蛋白的表达。方法以表达SARS刺突蛋白片段的工程菌BL21(DE3)/S为模型菌株,采用葡萄糖、甘油作为碳源,不同浓度的乳糖和异乳糖作为诱导剂,在摇瓶中进行表达实验。在40L发酵罐中进行验证。结果在摇瓶实验中,乳糖浓度大于0.5mmol/L即可以很好地诱导目的蛋白的表达,表达量与IPTG诱导时相当;葡萄糖的存在可以抑制乳糖,但不能抑制异乳糖的诱导作用;使用甘油作为碳源,既不抑制乳糖,也不抑制异乳糖的诱导作用。在发酵罐实验中,诱导初始阶段葡糖糖的存在抑制乳糖的诱导作用。结论在以乳糖操纵子为调控手段的工程菌表达系统中,可以使用乳糖作为诱导剂,诱导阶段应采用非葡萄糖碳源。     

人Leptin基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆Leptin基因,构建其重组表达菌株,并对表达产物进行免疫学鉴定。方法利用RT-PCR方法从脂肪细胞RNA中扩增出人瘦素前体(pre-Leptin)的cDNA片段和去信号肽序列的Leptin成熟基因片段,并插入pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达重组人瘦素(rh-Leptin)的菌株。结果DNA序列分析显示获得的pre-Leptin和成熟基因片段的序列与预计序列一致,菌株诱导后经SDS-PAGE检测,rh-Leptin表达量达菌体总蛋白的40%以上。Western blot分析显示重组Lep-tin具有免疫学活性。结论已获得高效表达Leptin的重组菌株。     

大肠杆菌色氨酸操纵子基因的克隆与表达

目的克隆并表达大肠杆菌色氨酸操纵子基因,提高其酶活性。方法利用PCR方法,从大肠杆菌31884基因组中直接克隆出色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pET-22b(+)中,构建重组质粒pET-22b(+)-Trpoperon,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析,并测定酶活性。结果凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为7000bp,SDS-PAGE鉴定目的蛋白分别得到了表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了2.7和3.2倍。结论已成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-Trpoperon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。