提高麻疹乙脑二联活疫苗热稳定性的研究

首先对3种保护剂冻干的麻疹乙脑二联苗进行滴度比较,结果3种保护剂的二联疫苗中麻疹病毒滴度差异均无显著意义;而对乙脑病毒滴度显示出保护剂Ⅱ和Ⅲ明显优于Ⅰ。选择保护剂Ⅲ制备二联苗和单价苗进行热稳定性试验,其中麻疹病毒在37℃对天及50℃72h的滴度下降均＜1．0Log。乙脑病毒在37℃14天及在50℃24h滴度下降均＜1．0Log。表明保护剂Ⅲ对麻疹沪191株和乙脑14－2株病毒的热保护作用均好。     

麻疹乙脑二联活疫苗对小鼠的保护力试验

在研制联合疫苗时，应考虑不同种型疫苗抗原同时注入机体后，其免疫应答反应是否存在相互干扰现象。作者将最近试制的麻脑二联活疫苗，用小白鼠效力试验，检测二联疫苗中乙脑疫苗对小鼠的保护力。以观察麻疹病毒对乙脑疫苗的免疫反应是否存在干扰作用。方法：按现行规程制备麻疹和乙脑活疫苗原液，检定合格后按适当配比混合，加人保护剂冻干制成麻脑二联活疫苗，测定乙脑滴度为7O～73Log＊＊U／（；麻疹病毒液度为40～“2引。（。g－【＊1o／ml；对照苗乙脑的价滴度为6．2。～7．35logPFU／n。l。二联苗与同批乙脑对照苗同时进行效力试验…     

麻疹、流行性腮腺炎二联活疫苗中量试制

用麻疹沪191株和流腮S79株中量试制麻疹、流腮二联活疫苗,对疫苗原液的配制比例、二联疫苗与单价疫苗的病毒滴度和稳定性进行比较。结果提高流腮疫苗原液的比例可获得较好效果;9批麻腮二联疫苗全部达到现行单价疫苗规程要求;二联疫苗在4～8℃保存18个月的稳定性与单价疫苗基本一致。     

麻疹乙脑二联减毒活疫苗安全性及免疫原性研究

目的研究麻疹乙脑二联减毒活疫苗的安全性及免疫原性。方法采用麻疹沪191毒株和乙型脑炎SA14142毒株分别制备的病毒原液,进行配比和干扰试验,制备成二联疫苗,冻干后免疫小白鼠和猴子,观察安全性和免疫原性,然后进行人体观察。结果麻疹病毒原液与乙脑病毒原液的最佳混合比例(体积比)为1∶2。注射小白鼠后安全性良好,且产生较好的乙脑免疫应答。注射猴子后无异常反应,神经组织病理学变化轻微,麻疹和乙脑中和抗体效价与各自的单价苗差异无显著意义。人体临床观察一般情况良好,无局部及全身反应。结论所研制的麻疹乙脑二联减毒活疫苗安全性及免疫原性良好,可推广使用。     

乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性

目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度,细胞病变法检测风疹病毒滴度;通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内;联合疫苗于37℃放置7 d,与放置前相比,风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1.0 LgCCID50/ml和1.0 LgPFU/ml,符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应;鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后,乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性,本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。     

麻疹-乙脑二联活疫苗脑内注射小白鼠的安全性及神经组织病理变化

目的　了解麻疹－乙脑二联活疫苗注射小白鼠脑内的安全性及神经组织病理变化。方法　小白鼠 脑内注射二联活疫苗后，观察体征反应和组织病理变化。结果注射后５～９ｄ有个别小鼠发病，１１～１４ｄ恢复正 常。脑组织病理检查时有轻微病变，７ｄ较明显，２１ｄ基本消退；病变以神经细胞变性及炎性细胞浸润为主，病变 分值在Ｖ－１，个别达Ｖ－２级。上述结果与同批单价乙脑活苗相同，而同批单价麻疹活苗和冻干保护剂却无体征反 应，也无组织病理损伤。结论二联苗注射小白鼠脑内后的体征反应和脑组织病理变化系乙脑１４－２株病毒所致。     

无明胶保护剂在麻疹风疹联合减毒活疫苗中的应用

目的研制一种安全有效的无明胶保护剂,并应用于麻疹风疹联合减毒活疫苗的制备。方法制备麻疹风疹联合减毒活疫苗原液,取同一批麻疹病毒原液,分别加入不同成分和配比的无明胶保护剂,制成成品,以含明胶保护剂作对照,检测成品外观、病毒滴度及水分,确定保护剂的成分,再确定保护剂的配比。将麻疹与风疹病毒原液混合,加入筛选出的无明胶保护剂,制备麻疹风疹联合减毒活疫苗(共3批),同时制备3批含明胶保护剂对照疫苗。按《中国药典》三部(2010版)要求对联合疫苗原液、半成品、成品进行检定;分别将制备的联合疫苗于2～8℃放置3和6个月,检测疫苗外观、病毒滴度及水分的变化,于37℃放置1、2、3、4周,检测病毒滴度的变化;按《中国药典》二部(2010版)要求进行过敏试验。结果含海藻糖和右旋糖酐成分的保护剂为首选保护剂。制备的无明胶保护剂联合疫苗原液、半成品及成品的各项检定指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求;无明胶保护剂联合疫苗成品于2～8℃放置6个月的水分和病毒滴度及37℃放置4周的病毒滴度与对照组疫苗相比,差异均无统计学意义(P>0.05);注射了无明胶保护剂联合疫苗的豚鼠在试验期内均未发生过敏反应,符合《中国药典》二部(2010版)的要求。结论无明胶保护剂对麻疹和风疹病毒具有较好的保护作用。     

采用一批细胞基质同时收获甲肝和麻疹病毒

目的 采用一批细胞基质同时收获甲肝和麻疹病毒。方法 应用甲肝 L-A-1株和麻疹 27D3株,间隔3周先后感染同一批人胚肺二倍体细胞2BS株,待两种病毒同时达到增殖高峰期时收获病毒液（以下简称HAM）,并分别进行病毒滴定、特异性检查、猴体安全性和免疫效果试验。结果HAM的甲肝和麻疹病毒滴度与同批单价甲肝和麻疹疫苗病毒滴度,差异均无显著意义。结论 该方法用于制备甲肝-麻疹联合疫苗,操作简便,省时省力,并可显著降低疫苗生产成本。     

细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用

目的采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,制备脊髓灰质炎减毒活疫苗。方法用细胞工厂和15 L转瓶分别培养人二倍体细胞(2BS),扩增至36代后,分别接种0.20 MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种,待细胞病变达100%时收获病毒液,加入保护剂(4.5 mol/L氯化镁溶液),制备单价疫苗,分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10∶1∶6的比例混匀,制备成三价疫苗半成品,分装入1 ml西林瓶中(每瓶为10人份剂量),即为疫苗成品。采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度,同时进行其他各项检定,并考察疫苗成品的稳定性。结果采用相同的感染复数接种病毒,细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液,Ⅰ型平均滴度高0.17 log10CCID50/ml,Ⅱ型平均滴度高0.33 log10CCID50/ml,Ⅲ型平均滴度高0.27 log10CCID50/ml;细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗,三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10CCID50/ml,符合国内外标准;疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格;细胞工厂制备的3批疫苗成品于37℃放置2 d,疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,且病毒滴度下降未超过0.5 log10CCID50/0.1 ml,于2~8℃放置9个月,疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,均符合WHO的标准要求。结论利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗,可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度,且工艺稳定,质量可控,可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产。     

北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘联合减毒活疫苗中的稳定性

目的观察北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘(measles-mumps-rubella-varicella,MMRV)联合减毒活疫苗中的稳定性。方法将4批MMRV联合减毒活疫苗成品分别置37℃保存4周、2~8及-15~-20℃保存24个月,采用蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU)试验检测不同时间点疫苗中水痘病毒滴度。将水痘病毒原液于-80℃反复冻融1、2、3次后,分别与麻疹、腮腺炎、风疹各单价疫苗原液按一定比例配制成MMRV联合减毒活疫苗,进行冻干,采用PFU试验分别测定冻干前、冻干后基础水痘病毒滴度及冻干后于37℃热稳定1周的水痘病毒滴度。结果 4批MMRV联合减毒活疫苗成品于37℃保存4周后,水痘病毒滴度下降范围为0.5~0.7 lg PFU/ml;于2~8℃保存24个月,水痘病毒滴定最高达4.6 lg PFU/ml,最低为4.4 lg PFU/ml;于-15~-20℃放置24个月,水痘病毒滴度基本保持不变,均达合格标准(不低于3.6 lg PFU/ml)。水痘病毒原液经1、2、3次冻融后制备的MMRV,通过37℃热稳定1周,水痘病毒滴度分别为4.9~4.6、4.6~4.4、4.5~4.3 lg PFU/ml,均达到合格标准(不低于3.6 lg PFU/ml)。结论北京株(VZV84-7)水痘病毒在MMRV联合减毒活疫苗中稳定性良好。     

乙型脑炎狗肾细胞活疫苗的人体接种观察

乙型脑炎狗肾细胞14－2PDK-CD株活疫苗于甘肃省武威市（非流行区）45人．接种观察表明，反应轻微，且抗体应答良好．疫苗接种后仅有4．65％的儿童出现低热反应（37．1～37.3℃），48～72小时后消失．儿童接种1针（0．5ml）后其抗体效价≥1∶5者占92．9％、≥1∶10者占42．9％；次年加免1针后，血清中和抗体效价百分之百上升至≥1∶10，GMT为29．3±1．44。成人接种1针（1．0ml），其抗体效价即上升至≥1∶10．与同时进行的乙型脑炎地鼠肾细胞14－2HK株活疫苗比较，其结果均无明显差异，表明两株活疫苗的免疫原性相似。     

乙型脑炎病毒SA_(14)-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性

目的研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据。方法将JEVSA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较。结果各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势。8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用。E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2142或2143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变。4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化。PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3′端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上。结论JEVSA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒种(SA14-14-2株)及其疫苗的表型和E基因稳定性研究

目的　对乙脑减毒活疫苗SA14 14 2株生产毒种及其疫苗病毒滴度、脑内毒力和E区核苷酸序列进行回顾性测定。方法　应用乳金黄地鼠肾传代细胞 (BHK 2 1)结晶紫蚀斑法进行病毒滴度的测定 ,小鼠脑内法检测疫苗脑内毒力。应用RT PCR方法扩增SA14 14 2生产毒种和疫苗E区的核苷酸 ,经凝胶层析纯化的PCR产物直接用于测序或克隆到pGEM T载体中 ,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果　疫苗在 - 2 0℃保存长达 10多年 ,疫苗病毒滴度下降不超过 0 5lg;脑内毒力未见毒力回升。病毒蚀斑形态仍保持较SA14野毒株形态小的特性 ;以不同批次疫苗和生产毒种提取的病毒RNA作为模板进行RT PCR扩增 ,扩增的基因片段与预期大小一致 ;E区基因序列与野毒株差异的 8个氨基酸没有一个发生回复突变。结论　SA14 14 2生产毒种及其不同年度不同批次疫苗的生物表型和E区核苷酸的特性是十分稳定的     

麻疹乙脑二联活疫苗猴体神经毒力试验

目的 观察麻疹乙脑二联活疫苗对猴体的安全性。方法 应用麻疹乙脑二联活疫苗注射恒河猴 脑内和脊髓,以麻疹和乙脑单价苗作对照,进行临床体征和组织病理学观察以及抗体测定。结果 全部试验猴临 床体征无异常反应,组织病理学检查联苗组大脑皮质和中脑黑质、颈髓仅见轻微炎症反应,病变均＜５％,未见神经 细胞坏死现象。麻疹抗体应答较好,乙脑抗体有轻微的升高。结论 麻疹乙脑二联活疫苗的神经毒力与两种单价 苗比较未见增强。     

乙型脑炎减毒活疫苗(SA_(14-14-2))病毒原液及成品疫苗的稳定性观察

目的观察乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗(SA14-14-2)病毒原液及成品疫苗的稳定性。方法取3批乙脑减毒活疫苗病毒原液,分别于20～25、2～8、-18～-22及-38～-42℃储存,间隔一定时间取样,检测病毒滴度;将2～8、-18～-22及-38～-42℃储存的在观察末期符合规定的病毒原液制备成品疫苗,观察其于2～8℃储存的稳定性。结果3批疫苗病毒原液在20～25℃储存16h、2～8℃储存12d、-18～22℃冻存3个月及-38～-42℃冻存6个月,病毒滴度均符合《中国药典》三部(2005版)的要求;由2～8℃储存12d、-18～-22℃冻存3个月、-38～-42℃冻存6个月的病毒原液所制备的成品疫苗2～8℃储存24个月,病毒滴度下降缓慢,且热稳定性良好,符合《中国药典》三部(2005版)的要求。结论乙脑减毒活疫苗病毒原液的稳定性随温度的变化而变化,温度越低,稳定性越好;所制备的相应成品疫苗,在观察期内稳定性良好。     

流行性乙型脑炎14-2株病毒在乳狗肾细胞上的适应性

流行性乙型脑炎14－2株弱病毒在乳狗肾细胞上连续传11代，1代的病毒滴度即达6．21LogPFU／ml，1代后各代病毒滴度无显著升高（6．18～6．40LogPFU／ml）。传代后的病毒对3周龄小鼠脑内无毒力，皮下无致病力，经乳鼠脑内传代后的脑内毒力为1．5～3．0LogLD5／0．03ml，与14－2原株的持世无显著差异。用乳狗肾细胞为基质制备的冻干活疫苗，经全面检定完全符合现行《乙型脑炎活疫苗规程》标准。     

乙型脑炎减毒活疫苗病毒SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种后的生物学和分子生物学特性

目的研究乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后的生物学和分子生物学特性,进一步评价该株病毒的稳定性和安全性。方法将乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株胸腔接种的三带喙库蚊研磨,离心收集上清液,接种于BHK21细胞中培养,得到SA14-14-2M1C1病毒液。应用空斑形成单位法测定病毒滴度,再进行小鼠脑内毒力测定和乳鼠脑内回传后毒力返祖试验。提取病毒RNA,RT-PCR扩增E基因片段,测序后与SA14-14-2原株的E基因序列进行比较分析。结果SA14-14-2M1C1病毒液滴度达1.4×107PFU/ml,小鼠脑内毒力测定结果无小鼠发病死亡,乳鼠脑内传代对小鼠的脑内致病力很低,毒力为1.9LgLD50/0.03ml,小于《中国药典》规定的3.0LgLD50,且皮下注射未见小鼠发病死亡。扩增出的E基因片段序列与原株相比较,只有E区1340位一个核苷酸的变化A→G,导致E447位1个氨基酸的改变D(Asp)→G(Gly),此差异位点不是SA14-14-2株发生基因变异的8个位点之一。结论SA14-14-2疫苗株病毒经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后,其生物学(弱毒)特性和基因特征(E区8个氨基酸突变)未发生改变,进一步证实了该病毒的稳定性。