全自动免疫磁珠法与免疫亲和柱法测定食用油中黄曲霉毒素B1的对比研究

采用全自动免疫磁珠净化与免疫亲和柱净化的前处理方法，结合超高效液相色谱法对不同食用油中黄曲霉毒素B₁进行定量检测，并对两种前处理方法结果准确性、加标回收率、检测时间进行了对比。结果表明：全自动免疫磁珠净化与免疫亲和柱净化测定植物油标准物质，结果分别为15.59μg/kg和14.64μg/kg，均在标准值范围内；对不同种类食用油添加不同量的黄曲霉毒素B1标准物质，加标回收率均在88%～110%之间，相对标准偏差均在5%以内。采用Bland-Altman法对全自动免疫磁珠净化法和免疫亲和柱净化法进行差异分析，结果显示这两种净化方法的差异在可接受范围内。两种方法在净化和富集食用油中黄曲霉毒素B₁均可满足实验要求，可以互相代替使用。通过检测时间对比，全自动免疫磁珠净化搭配使用真菌毒素全自动净化仪前处理方法可同时处理多个样品，平均一个样品净化时间小于3 min，处理时间短、实验效率更高。     

基于免疫磁珠黄曲霉毒素全自动净化方法适用性评价

对基于免疫磁珠黄曲霉毒素全自动净化的方法适用性进行研究。结果表明:免疫磁珠试剂盒平均回收率均在95%以上,相对标准偏差小于3.3%。质控样品的测定结果均在给参考值范围内。通过t检验可知,sig.(双侧)=0.533,两台净化仪的检测结果没有显著性差异。通过62名检测人员对黄曲霉毒素免疫磁珠自动化处理方法与传统的免疫亲和柱净化法的评测,通过t-检验可知,99%的置信区间内,P值≥0.01,说明两种方法的测定值没有显著性差异,但是免疫磁珠自动化处理法测定结果的离散程度小于免疫亲和柱法,且全部的检测结果的|Z|均≤2。     

免疫磁珠高通量自动净化-超高效液相色谱法测定粮食中玉米赤霉烯酮

基于免疫磁珠高通量自动净化的前处理方法,使用超高效液相色谱仪对粮食中玉米赤霉烯酮的含量进行测定。首先将免疫磁珠与玉米赤霉烯酮的反应时间、样品提取液和不同粮食基质的净化效果进行优化。经方法验证,超高效液相色谱的检出限和定量限分别为3.5 μg/kg和12.0 μg/kg。在优化条件下,全麦粉和玉米全粉阴性样品的3 个添加水平的加标回收率在99.04%～109.26%之间,变异系数不大于6.88%。玉米全粉、全麦粉、糙米粉、小麦粉等粮食基质中玉米赤霉烯酮成分的国家有证标准物质或质控样品的测定结果在标准值及其扩展不确定度范围内,变异系数不大于3.54%,测定结果较为满意。采用Bland-Altman法对免疫磁珠净化法和免疫亲和柱净化法之间的差异进行分析,结果显示这2 种净化方法的差异在可接受范围内,因此,这2 种方法在净化和富集粮食中玉米赤霉烯酮时可互相代替使用。免疫磁珠净化方法配套使用的真菌毒素全自动净化仪可同时净化10～24 个样品,平均每个样品的净化时间约为2～3 min,实现粮食中玉米赤霉烯酮的高通量自动净化。超高效液相色谱分析速度快、灵敏度高、准确性高,可用于检测粮食中玉米赤霉烯酮的含量。     

免疫磁珠高通量自动净化-超高效液相色谱法快速测定饲料中玉米赤霉烯酮

采用免疫磁珠净化饲料原料及其产品中的玉米赤霉烯酮,实现玉米赤霉烯酮的自动富集、清洗和洗脱,结合超高效液相色谱对玉米赤霉烯酮进行分析测试。本文对饲料样品稀释液进行了优化。根据3倍信噪比的峰响应值,本方法玉米赤霉烯酮的检出限为4.5 μg/kg,定量限为15.0 μg/kg,在10~500 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数（R2）为0.99993。玉米赤霉烯酮在鸡饲料和猪饲料样品中的加标回收率为92.6%~112.9%,相对标准偏差为1.0%~8.8%。对同一饲料基质进行连续4天同一浓度的加标实验,回收率为97.0%~98.9%,日间精密度在5.7%~5.9%。使用本方法与免疫亲和柱法进行比较,检测了19种饲料样品,t检验显示本方法与免疫亲和柱法无显著性差异。免疫磁珠自动净化法可同时净化24个样品,无需人员手动操作,减少实验误差,提高检测效率,满足饲料中玉米赤霉烯酮的日常检测要求。     

免疫磁珠结合PCR-试纸条法鉴定金枪鱼成分的研究

目的 建立一种快速检测金枪鱼成分的免疫磁珠结合PCR-免疫金标试纸条方法。方法 本研究使用免疫磁珠法提取金枪鱼样品的核酸,针对金枪鱼基因组特异性基因片段设计引物,优化反应体系和反应条件,建立金枪鱼成分PCR产物试纸条检测方法,验证方法的特异性、灵敏度和稳定性,并对市售金枪鱼产品进行检测。结果 免疫磁珠法提取市售金枪鱼样品DNA的纯度高。所建立的PCR-试纸条方法特异性强,仅金枪鱼能扩增出229bp特异性DNA片段,试纸条检测线变红,其他鱼类均无非特异性扩增条带,试纸条检测线未变红色;灵敏度高,达到0.01%;方法快速,PCR产物的试纸条判读时间5分钟。结论 该方法具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、简便环保等优点,适用于金枪鱼成分的快速检测。     

不同核酸提取方法用于多重荧光PCR法检测3种混合熟肉的比较分析

目的 探讨不同核酸提取方法以及蒸、煮、烤烹饪方式制作的混合熟肉制品的多重荧光定量PCR检测结果之间的差异。方法 用3种不同的提取方法：抽提法、离心柱法及磁珠法,提取经过蒸、煮、烤烹饪方式制作的牛、鸡、猪、鸭混合样品的DNA,通过对不同方法提取DNA的质量及提取DNA用于多重荧光PCR检测的效果方面进行比较。结果 三种方法提取DNA的浓度及纯度无明显差别,磁珠法提取的混合样品DNA进行多重实时荧光PCR检测的Ct值最小,扩增效果最佳。结论 该研究中磁珠法提取熟肉制品DNA的检测效果更为理想。     

副溶血性弧菌免疫磁珠的制备及其应用

研究比较了不同的免疫磁珠(Immunomagnetic Beads,IMBs)富集捕获副溶血性弧菌的能力。采用两种副溶血性弧菌多克隆抗体,分别包被经羧基和甲苯磺酰胺基基团修饰的磁珠,制备完成5个免疫磁珠(IMB-C1、IMB-C2、IMB-T1、IMB-T2和IMB-T3)。研究引入表面抗体浓度作为评价免疫磁珠捕获能力的特征性参数,两种副溶血性弧菌多克隆抗血清包被的羧基磁珠表现出了较高的表面抗体结合能力,分别为34.25fg/μm2和36.73fg/μm2,明显高于甲苯磺酰胺基磁珠。五个免疫磁珠对副溶血性弧菌捕获能力的研究结果表明:在起始菌液浓度为4.32logCFU/mL时(p<0.05),两个羧基磁珠捕获率达到79%和94%,均优于甲苯磺酰胺基磁珠。采用环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术对免疫磁珠菌体细胞复合物进行体外扩增,结果表明:磁珠的存在并未影响对菌体细胞的后续分子检测。本研究分析比较了不同免疫磁珠的捕获能力,得到羧基磁珠对副溶血性弧菌的捕获能力比甲苯磺酰胺基磁珠强,直接法和间接法偶联方式对免疫磁珠的富集捕获能力无影响。     

免疫层析法快速检测动物源性食品中五氯酚酸钠含量

目的 建立胶体金免疫层析法快速检测动物源性食品中五氯酚酸钠的检测方法,对不同基质采用与其相适应的提取方法及净化方式,实现食品中五氯酚酸钠的现场快速筛查。方法 样品经80%乙腈水溶液(含8%三乙胺)提取,猪肉、牛肉等肌肉不经净化、动物内脏及鸡蛋采用净化包(300mg无水硫酸钠+100mg C₁₈+100 mgN-丙基乙二胺)净化、鱼肉采用乙腈饱和的正己烷净化,净化后的提取液经浓缩、复溶、孵育,最后用五氯酚酸钠胶体金检测卡进行检测。结果 该方法检出限为1.0μg/kg, 2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚和苯酚对五氯酚酸钠的检测结果没有明显干扰。通过对样品进行加标检测,其结果与现行国家标准检测结果一致,并且20次重复结果一致,对46份样品进行检测,结果均为阴性,且免疫层析法结果与现行国家标准方法检测结果一致。结论 本方法具有简便、快速、低成本等特点,适合大批量样品的现场筛查,提高监管效率。     

磁珠载体-电化学免疫分析研究进展

磁珠不仅拥有巨大的比表面积和高效的分散能力,而且在其表面可以形成牢固的免疫复合物;同时利用磁珠的超顺磁性可以快速的将其分离,样品前处理简单,不需要预浓缩、净化等复杂工序就可以实现对目标物的快速检测。此外,电化学分析技术具有超高的灵敏度,因此将磁珠与电化学免疫分析技术相结合,利用两者的优点则给人们提供了一种新的检测思路。目前,该领域研究活跃,并取得了重要研究进展,开发出了灵敏度高、检测速度快、简便易用的微型电化学免疫检测系统,可以用于食品检测、环境评估和临床诊断等领域。本文介绍了以磁珠为固相载体的电化学免疫分析技术的最新研究进展,特别是从磁电极免疫分析、基于旋转圆盘电极的免疫分析、酶标记免疫磁珠分析和纳米粒子标记免疫磁珠分析四个方面进行具体论述,并对该领域的发展前景做了展望。     

全自动免疫磁珠分选系统检测沙门氏菌

目的研究全自动免疫磁珠分选系统对国标沙门氏菌检测方法的改进效果。方法从肉鸡专项监测中选取106份样品,采用全自动免疫磁珠分选系统和GB 4789.4-2010《食品微生物学检验沙门菌检验》进行沙门氏菌对比检测。与国标法相比,全自动免疫磁珠分选系统取消了SC和TTB增菌,经BPW增菌后直接使用系统富集目标菌并接种显色平板。结果免疫磁珠法阳性检出率为32%,国标法阳性检出率为31%,二者无显著性差异(P0.05)。但磁珠法取消了二次增菌的步骤,检测时间比国标法节省24 h,且平板上的单个菌落生长率和菌株特异性也更好。采用磁珠法检测的106份样品中,有34份样品检出可疑显色菌株,都有单个可疑菌落生长,最后均鉴定为目标菌沙门氏菌;采用国标法有38份样品检出可疑显色菌株,其中3份无单个可疑菌落生长经再次转种,最后有5株经鉴定为嗜水气单胞菌等干扰性杂菌,仅33株为目标菌沙门氏菌。结论全自动免疫磁珠分选系统特异性好、单个菌落生长率高且检测时间短,可以用于食品中沙门氏菌检验。     

一种检测活的非可培养状态空肠弯曲菌的新方法

为提高活的非可培养状态空肠弯曲菌的检出率,建立了一种免疫磁珠捕获-荧光聚合酶链式反应法。该法包括应用免疫磁珠技术制备弯曲菌免疫磁珠,以直接捕获受检样品中的空肠弯曲菌,并设计了检测空肠弯曲菌马尿酸酶(hipO)基因的引物与荧光标记探针。结果表明:磁捕获-荧光聚合酶链式反应法可直接检测空肠弯曲菌,无需增菌培养,具有灵敏度高、选择性好、简便、快速等特点,可在24h内完成样品中活的非可培养状态空肠弯曲菌的检测。     

不同前处理方法对粮油中黄曲霉毒素B1检测效果对比

考察3种前处理方法的净化效果,建立柱后光化学衍生-高效液相色谱法对粮食中黄曲霉毒素B1的检测方法.样品经甲醇+水(70∶30)提取,常规手动亲和柱净化、全自动亲和柱净化及免疫磁珠-全自动净化3种前处理净化,经Eclipse plus C18色谱柱分离,用64％水+18％甲醇+18％乙腈等度洗脱.优化色谱条件后,从加标回...     

DNA 提取方法对实时荧光定量 PCR 检测花生过敏原 Ara h 2 基因的比较研究

目前,食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠（Sodium Lauroyl Sarcosine）磁珠法（简称SLS磁珠法）的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生含量为0.05%～1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用一条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。     

盐干海参的2种核酸提取方法比对及其分子鉴定

目的 建立盐干海参的核酸提取及其分子鉴定方法。方法 选取5种盐干海参, 采用直接处理、洗涤处理和浸泡处理3种处理方式, 比较磁珠法和离心柱法两种核酸抽提方式的提取质量, 并采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)法对提取的核酸进行分析确认。结果 同一种抽提方式不同海参处理组间核酸质量没有显著差异, 而两种抽提方式间核酸质量差异显著, 其中磁珠法提取的核酸得率高、纯度高, 而离心柱法提取的核酸得率及纯度均偏低。经PCR扩增验证, 磁珠法提取的核酸效果较佳。将扩增产物进行测序及系统进化分析发现5种海参实际种类与标注名称仿刺参存在较大差异。结论 盐干海参处理方式对核酸提取结果影响不大, 磁珠法提取核酸效果较好,单纯依靠COI和16S rRNA基因通用引物并不能对所有的海参种类进行鉴定。     

酶联免疫吸附结合免疫亲和柱－高效液相色谱法检测大米中黄曲霉毒素B1的研究

对大米中两种检测黄曲霉毒素B1方法的结合使用进行了研究,即采用酶联免疫吸附法对大米中黄曲霉毒素B1进行初筛,对可疑样品采用免疫亲和柱-高效液相色谱法进行验证。样品经甲醇水提取、免疫亲和柱净化、高效液相色谱分离、碘柱后衍生、荧光检测器测定。结果表明,黄曲霉毒素B1线性关系良好,相关系数为0.9999,检出限为0.50μg/kg,回收率为89.4%~95.2%,RSD值为1.88%~3.05%。两种方法的结合应用,适用于较大批量样品的检测。     

抗原肽免疫磁珠检测BLV抗体的研究

建立抗原肽偶联磁珠进行BLV抗体的检测技术,探讨肽偶联磁珠的条件及效力。对牛白血病病毒gp51和p24蛋白的抗原表位进行预测分析,合成3条抗原肽,把合成肽与表面带-COOH功能团的磁珠进行偶联,形成固定化,反应原性良好的免疫磁珠,用于BLV抗体的检测。确定了肽与磁珠最佳偶联条件,3种免疫磁珠均有反应原性,gp51蛋白上的253-266:SSFNTTQGWHHPSQ线性序列具有最佳的检测结果。利用免疫微球对191份样品进行检测,结果与国外牛白血病检测试剂盒进行对比,检测符合率为92.6%。gp51蛋白上存在BLV的优势B细胞线性表位;抗原肽免疫磁珠可以用于检测BLV抗体,这为进一步研制液体磁流芯片了奠定基础。     

基于免疫磁珠的胶体金免疫层析法快速检测水产品中地西泮残留

本研究针对水产品中地西泮残留的问题,建立了一种快速、灵敏的免疫磁珠-胶体金免疫层析法。采用链霉亲和素磁珠与生物素化地西泮单克隆抗体偶联制备的免疫磁珠,快速富集、分离水产品中地西泮残留,并结合胶体金免疫层析法进行半定量检测。结果表明,经过优化后试剂卡最佳工艺为金标抗体标记量25 μg/mL、T线抗原包被量0.6 mg/mL、C线羊抗鼠二抗包被量1.5 mg/mL、金标喷量3.0 μL/cm,地西泮加标浓度为1.0、5.0、10.0和15.0 μg/kg时回收率为78.34%~90.40%,相对标准偏差(RSD)为5.03%~8.96%。本方法特异性强、稳定性好,可在25 min内完成单个样本检测,对水产品中地西泮残留检出限为0.5 μg/kg,优于常规前处理法。经验证,对40份水产品样本检测结果与GC-MS法结果一致,证明免疫磁珠-胶体金免疫层析法可作为水产品中地西泮残留快速检测的有效手段。     

现行黄曲霉毒素液相色谱检测法的比较与评价

目的 综合评价检测黄曲霉毒素的几种现行液相色谱-荧光法。方法 采用均质(涡旋)、超声辅助液液萃取技术对样品中的黄曲霉毒素进行提取, 免疫亲和柱和多功能柱净化。并采用不同的检测技术[三氟乙酸(TFA)柱前衍生法、光化学柱后衍生法、碘和溴柱后衍生法、大体积流动池直接检测及光化学柱后衍生串联大体积流动池]对玉米质控样品中黄曲霉毒素进行了分析。结果 各方法的检测结果均较理想, 可满足常规样品的检测要求。结论 超高压液相色谱-大体积流动池检测法在有效提高工作效率的同时, 大量减少了有毒有害试剂的使用量, 且具有最高的检测灵敏度, 可满足GB 2761-2011中对各类样品中黄曲霉毒素的限量要求。采用乙腈-水或甲醇-水体系均能达到较好提取黄曲霉毒素的目的。免疫亲和柱的净化效果较多功能柱好。     

特约专栏(二)“粮油质量安全与评价”

专栏介绍本专栏"粮油质量安全与评价"的四篇稿件围绕粮油质量安全自动化和绿色环保检测技术、方法不确定度评估以及污染物风险因素防控决策等方面,报道了一些研究进展。免疫磁珠真菌毒素净化方法具有操作简单、自动处理、高效快速和结果可靠等优点,《基于免疫磁珠黄曲霉毒素全自动净化方法适用性评价》评价了该方法在日常粮食样品黄曲霉毒素检测和批量监测中的适用性。     

免疫亲和柱净化高效液相色谱法与酶联免疫吸附法测定小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

采用免疫亲和层析净化高效液相色谱(HPLC)法与酶联免疫吸附(ELISA)法测定小麦样品中的脱氧雪腐镰刀菌稀醇。结果显示:HPLC法和ELISA法的标准曲线线性相关性均良好,相关系数分别为0.999和0.994;三水平加标回收率分别为88.9%~92.3%和104.4%~119.4%,相对标准偏差(n=6)分别为1.73%~7.17%和2.25%~9.65%;进行F检验法和t检验法分析,说明两种方法检测结果无显著性差异性。此两种方法均具有回收率高、重现性好、特异性强等特点,ELISA法适合于大批量样品的检测和筛选,HPLC法适合于逐个样品的分析。