高山红景天中糖基转移酶家族cDNA全长基因的克隆

为了获得高山红景天中红景天苷生物合成关键酶-- UDP- 糖基转移酶家族基因的全长cDNA 序列,采用在线简并引物设计软件结合3′-RACE 技术获得两个糖基转移酶基因的3′端部分序列,进一步采用不同的5′-RACE试剂盒扩增两个基因的5′端序列,结果显示利用Takara 公司的试剂盒扩增可以得到cDNA全长序列(GenBank登录号为EF508689 和EU567325),而采用Invitrogen 公司的试剂盒得到的序列不包括全部开放读码框。实验证明,利用Takara 公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 克隆获得基因全长序列的比率更高。     

烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

根据GenBank中拟南芥RAX基因序列, 在烟草EST数据库中进行Blastp检索, 获得与之同源性较高的蛋白质序列, 选取同源性最高的蛋白质序列所对应的核酸序列, 设计引物, 获得中间片段, 再运用中间片段设计引物, 应用RACE方法获得其5′和3′末端cDNA序列, 将获得的3段序列拼接, 结合全长克隆测序验证, 获得一个新的普通烟草基因, 将其命名为NtRAX(NCBI登录号为JQ228591)。NtRAX的cDNA全长为1112 bp, 5′端非编码区96 bp, 3′端非编码区62 bp, 编码区长度为954 bp, 编码317个氨基酸, 预测的分子量是35.42 KDa。对该基因进行序列分析和功能预测, 得出该基因属于MYB基因家族, 是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。     

分枝犁头霉WL511热稳定α-半乳糖苷酶基因克隆及序列分析

构建并筛选耐热分枝犁头霉cDNA文库获得639 bp热稳定α-半乳糖苷酶基因片段,并以5′-RACE和3-′RACE技术获得上下游片段1817 bp和1092 bp,拼接得α-半乳糖苷酶全长序列2228 bp,其完整开放读码框为2142 bp,编码713个氨基酸,G+C含量43%;产物预测等电点5.2,预测相对分子质量81000。该基因(GenBank No.DQ234280)属α-半乳糖苷酶36家族,与其他来源的α-半乳糖苷酶基因同源性较低,与链霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680的α-半乳糖苷酶同源性最高为38%。     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum cul.Jiucaiping2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。     

嗜虫书虱β3- actin基因克隆及定量PCR方法的建立

旨在建立嗜虫书虱的实时荧光定量PCR分析方法,为嗜虫书虱基因的定量分析提供技术支持.利用RT - PCR方法,从嗜虫书虱体内克隆获得了β- actin基因cDNA片段(GenBank登录号:FJ041117),该基因片段长度为822 bp,编码273个氨基酸残基(从第3个碱基开始编码).根据此β- actin基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ染料技术的实时荧光定量PCR方法.建立的嗜虫书虱β- actin实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短,为β- actin作为内参基因进行嗜虫书虱功能基因的定量分析奠定了基础.     

烟草钾离子通道基因NKT5的克隆和序列分析

本研究运用已经获得的1条490bp的普通烟草钾离子(K~+)通道基因的中间片段来设计特异性引物,应用RACE方法获得其3'和5'末端cDNA序列。通过三段cDNA序列拼接结合全长克隆测序验证,获得一个未报道的普通烟草K~+通道基因,并将其命名为NKT5(NCBI登录号为HM010922)。NKT5的cDNA全长为2365bp,其中5'端非编码区190bp、3'端非编码区249bp、编码区1926bp,编码641AA。对该基因进行了序列分析及功能预测,为进一步阐明其在烟草吸钾及抗逆过程中的功能及分子机制奠定了基础。     

西兰花(Brassica oleracea var.italica)硫代葡萄糖苷酶基因 cDNA分子克隆及其特征分析

目的:研究西兰花硫代葡萄糖苷酶(简称硫苷酶)cDNA的结构特征,为硫苷酶异源表达打下基础.方法:以西兰花幼苗为试材.根据同源序列法PCR扩增硫苷酶特异cDNA片段,再用3＇RACE和5＇RACE分别扩增cDNA 3＇端序列和5＇端序列,经序列拼接获得西兰花硫苷酶全长cDNA序列.利用在线蛋白质分析系统对其编码的氨基酸序列进行结构特征分析.在NCBI CDD数据库中查找保守结构域,在SWISS-MODEL上进行在线蛋白同源模建,用MEGA3.1构建NJ系统树.结果:该基因cDNA全长1830bp,含有一个1641bp的ORF及31bp的5＇端非翻译区和158bp的3＇端非翻译区,命名为BoMyr2(GenBank登录号为EU004075);编码氨基酸序列含有20个氨基酸长度的信号肽及9个天冬酰胺N末端糖基化位点,编码的蛋白分子质量(Mw)约为62.2 kD,等电点(pI)为8.71;BoMyT2推测氨基酸序列舍有糖基水解酶家族1特有的糖基水解酶结构域,其编码蛋白与PDB库中白芥硫苷酶有类似的三维结构,具有明显的β/α(TIM)桶结构;BoMyr2应归为硫苷酶基因家族的MB亚族.     

GDHt-β亚基基因的套式PCR扩增及其DNA测序

采用套式PCR技术，从肺炎克氏杆菌A．S．1．1736基因组中扩增编码GDHt-β亚基基因，对目的基因进行测序并应用生物信息学进行序列分析，结果扩增出约585 bp的目的DNA片段，经GenBank检索对照分析，该基因序列与国外文献报道的同源性达99．34%，表明成功地获得编码GDHt-β亚基的基因，为进一步研究该亚基的结构与生物学功能奠定了基础。     

GLGI技术鉴定奶山羊乳腺中的к-酪蛋白基因

采用GLGI技术扩增本实验室构建的Long-SAGE标签库中的к-酪蛋白基因.使用SMARTTM RACE cDNA Ampliication Kit通过RT-PCR把奶山羊乳腺组织中的rnRNA逆转录成cDNA.分别用3′RACE和5′ACE扩增к-酪蛋白基因的3′端和5′端.扩增产物经TA克隆后转化大肠杆菌,随机挑取阳性克隆后进行测序分析.通过序列比对、拼接,获得全长的к-酪蛋白基因.应用GLGI技术成功获得了完整的奶山羊乳腺CSN3序列,为CSN3结构分析和功能研究奠定了重要基础.     

苦荞和甜荞二氢黄酮醇4-还原酶基因（Dfr）的克隆及序列分析

采用同源基因克隆的方法,以苦荞和甜荞叶片为材料,提取总RNA,经RT-PCR 扩增获得其二氢黄酮醇4- 还原酶基因(dfr)cDNA 序列,并通过T 载体克隆后测序。序列分析表明,获得了苦荞和甜荞dfr 的全长cDNA编码序列,其1026bp 的全长开放阅读框(ORF)均编码341 个氨基酸,并具典型的dfr 结构特征和功能模块。同源性分析显示,苦荞和甜荞与其他植物的dfr 基因核苷酸相似性为71%～98%;根据氨基酸序列构建系统进化树表明,二者与豆科、桑科和蔷薇科聚为一类。     

普通烟草抗渗透胁迫基因NtP5CS的克隆与表达分析

从普通烟草中克隆脯氨酸合成的关键酶基因P5CS,分析其序列特征、进化关系、表达模式,以期为烟草的抗逆研究奠定基础。设计兼并引物获得P5CS基因中间片段,利用RACE技术扩增其全长cDNA;采用生物信息学技术分析该基因的序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用RT-PCR研究其表达模式。从受干旱胁迫诱导的普通烟草品种中烟14中克隆到全长为2584bp的烟草P5CS基因,命名为NtP5CS,GenBank登录号为HM854026,开放读码框为2160 bp,编码719个氨基酸。经Blast同源性比对分析,该序列与番茄tomPRO2基因在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。系统进化树分析显示,NtP5CS与番茄tomPRO2基因可能是直系同源基因。RT-PCR分析表明,干旱、低温、ABA、高盐等胁迫条件均可诱导NtP5CS基因的上调表达,且在旺长期和胁迫条件下根和叶中表达量最高。首次从普通烟草中克隆得到P5CS基因,该基因对水分胁迫响应,可能参与普通烟草抗渗透胁迫反应。     

烟草叶片表面抗性蛋白T-phylloplanin基因的克隆

从烟草突变体T-cldf叶片表达基因的SSH文库中,筛选到一个与真茵抗性相关的表达序列标签P1T10(GenBank Access No.EBl02896).以P1T10序列为模板设计引物,用末端快速扩增(RACE)技术扩增得到T-Phylloplanin的cDNA全长(GenBank Access No.DQ451214).利用DNA STAR软件的EditSeq程序(Version 5.01)分析T-Phylloplanin基因,显示它包含一个完整的开放读码框,编码一个含有110个氨基酸、等电点为7.74、分子量为11.3 kD的小分子量蛋白(GenBank Access No.ABE03627).通过BLAST比对发现它与烟草叶片的一个表面抗性蛋白全长基因(GenBank Access No.AY705384)的同源性为93%.通过半定量RT-PCR分析表明,T-Phylloplanin在烟草突变体T-cldf叶片中的表达量高于烟草K346.     

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-1基因克隆和序列分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉XZ-3S中扩增并克隆了木聚糖酶(Xyn ZF-1)基因的cDNA片段,测序结果表明,Xyn ZF-1基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,推测分子量为24.06ku,等电点为5.20。以XZ-3S基因组DNA为模板扩增Xyn ZF-1的DNA序列,该序列仅存在一个内含子,长度为68bp。成熟肽基因推导的氨基酸序列与其他微生物来源的木聚糖酶一级结构进行比较,同源性最高达到了89.47%。系统进化树分析该酶属于G/11族糖基水解酶。又进一步对Xyn ZF-1二级结构进行了分析,并通过SWISS-MODEL预测了该酶的三维结构。     

嗜虫书虱β-actin基因克隆及定量PCR方法的建立

旨在建立嗜虫书虱的实时荧光定量PCR分析方法,为嗜虫书虱基因的定量分析提供技术支持。利用RT-PCR方法,从嗜虫书虱体内克隆获得了β-actin基因cDNA片段(GenBank登录号:FJ041117),该基因片段长度为822 bp,编码273个氨基酸残基(从第3个碱基开始编码)。根据此β-actin基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green I染料技术的实时荧光定量PCR方法。建立的嗜虫书虱β-actin实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短,为β-actin作为内参基因进行嗜虫书虱功能基因的定量分析奠定了基础。     

绿色木霉葡聚糖内切酶(EGⅠ)基因克隆及在酿酒酵母中的表达

以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为1 400 bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的E00390葡聚糖内切酶序列相比,氨基酸序列同源性达91%。将EGⅠ基因构建入表达载体pESC中,在GAL10启动子控制下,目的基因在酿酒酵母Fm135a中成功表达,所得葡聚糖内切酶经初步纯化后,SDS-PAGE检测为49 kD,比活力为2.45 U/mg。     

橙色红曲菌乳清苷-5'-磷酸脱羧酶基因的克隆

根据已报道的真菌乳清苷-5-磷酸脱羧酶(pyrG)氨基酸序列,采用CODEHOP策略设计简并引物,从橙色红曲菌(Monascus aurantiacus)的基因组DNA中克隆得到pyrG基因片段.然后运用PCR法筛选橙色红曲菌Fosmid文库,获得了pyrG基因全长(GenBank登录号:GU723506).经过blastx比较发现,橙色红曲菌pyrG基因与Aspergillusflaw NRRL3357的氨基酸序列同源性最高,达到81%.该基因能够作为筛选标记应用于橙色红曲菌同源转化系统.     

烟草橙蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了获得烟草OR(NtOR)基因的全长序列和进一步揭示其在特色烟叶形成中的作用,采用同源克隆法从烟草品种K326中克隆了NtOR的全长cDNA和基因组DNA序列,GenBank登录号为JN379458和JN375578.生物信息学分析表明,NtOR基因组DNA全长5027bp,cDNA为1188 bp,编码317个氨基酸残基.NtOR蛋白具有2个跨膜域、1个信号肽剪切位点、5个糖基化位点和11个磷酸激酶修饰位点,二级结构包含12个α-螺旋和20个β-折叠,亚细胞定位于质膜上.系统进化与BLAST分析表明,NtOR是SlOR和ViOR的垂直同源基因.GENEVESTIGATOR数据库的芯片结果显示,NtOR基因在子叶中的表达量最高,其次是成熟叶片、幼茎和花,其他组织器官的表达相对较弱.     

植物乳杆菌P8亚油酸异构酶基因及其上游非编码区的克隆与分析

依据GenBank中已公布的亚油酸异构酶基因,设计一对特异性引物,PCR扩增该基因后,克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定和序列分析表明,亚油酸异构酶基因大小为1720bp。该基因与植物乳杆菌AS1.555(DQ227322)的同源性达到99%,与泡菜植物乳杆菌(DQ010331)的同源性达到89%。该基因序列在GenBank上注册,编号为HM569265,对其进行生物信息学分析发现,基因中含有一段低复杂性区域。分析乳酸杆菌(CP001617)基因组全序列,设计了亚油酸异构酶基因上游非编码区805bp片段的特异性引物,PCR扩增该片段后将其克隆到T载体上并转化到Trans1-T1感受态细胞中。经菌落PCR鉴定后,进行序列分析和生物信息学的初步分析,预测出该片段中有12个基序,以及6个转录调控元件。