骨形态发生蛋白-7在E.coli中的可溶性表达

骨形态发生蛋白-7(BMP-7)属于转化生长因子(TGF-β)家族中的成员,有很强的骨诱导作用.为了获得可溶性的rhBMP-7,利用SOE-PCR法获得链球菌G蛋白B1域(GB1)目的基因,构建GB1、连接肽、6His-tag、EKsite (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-7融合表达型载体,转化E.coliBL21 (DE3).工程菌在28℃下经0.1 mmol/LIPTG诱导后,可获得表观分子量约为28 kD的以可溶形式表达的GB1-BMP-7融合蛋白.     

提高碱性磷酸酶在E.coli胞内表达的可溶性及活性

以E.coli DH5a基因组为模板PCR扩增得到无信号肽的碱性磷酸酶基因片段,与胞内融合表达型T栽体连接得到重组质粒,转化表达宿主E.coli BL21(DE3)和E.coli origami(DE3),经0.1 mM IPTG诱导表达,超声破碎细胞后,SDS-PAGE分析可溶性,融合蛋白在E.coli origami(DE3)中的可溶蛋白含量比E.coli BL21(DE3)中高.融合蛋白的可溶部分经Ni2+螯合亲和纯化,纯化后E.coli origami(DE3)中蛋白活性比E.coli BL21(DE3)中明显提高,达到1 614.3U/mg蛋白.     

重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中融合可溶表达

将N-利用基质(NusA)和人骨形态发生蛋白-2成熟肽(hBMP-2m)的编码基因进行基因融合,实现了hBMP-2m在大肠杆菌中的融合可溶表达.以大肠杆菌基因组DNA为模板PCR扩增得到NusA基因,通过NdeⅠ和AflⅡ酶切位点将其置换出重组融合表达载体pDsbA-hBMP-2m中的DsbA基因,使hBMP-2m基因重组于NusA基因的下游,重组质粒转化E.coli BL21(DE3),获得工程菌.在30℃条件下,经IPTG诱导表达后,融合蛋白占细胞总蛋白的45%左右,并且主要以可溶形式存在,可溶部分达90%以上.经过简单的Ni 2+柱一步纯化即可得到纯度较高的融合蛋白.通过融合表达的方式表达出可溶性的目的蛋白,有望复性后通过肠激酶酶切得到hBMP-2m单体,进一步二聚体化得到具有生物活性的hBMP-2m.     

TRAIL 胞外区编码基因的设计、人工合成及其表达

根据大肠杆菌密码子偏爱性要求, 设计编码TRAIL 胞外段(114 ～ 281 氨基酸)的DNA 序 列, 分段合成拼接引物并连接, 得到目的基因, PCR 扩增后克隆于T 载体中, 经测序证实后, PCR 法在目的基因的5′, 末端引入肠激酶识别位点EKsite 的编码序列, 重组于胞内融合表达型T 载体 中, 构建成pDsbA-6Hi s-EKsi te-TRAI L 胞内融合表达质粒, 重组质粒转化表达宿主E .coli BL21 (DE3).在33 ℃条件下, 添加终浓度为0 .4 mmol/L 的IPTG 诱导表达, 全菌SDS-PAGE 分析结果 表明:所构建的工程菌能表达44 kD 左右的TRAI L 融合蛋白, 与理论值相符.     

Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.     

谷氨酸生产菌B44的基因工程构建

从大肠杆菌E.coli K12中通过PCR扩增出磷酸果糖激酶编码基因(pfkA),将其与表达载体pCMVTNTTMvector连接构建成重组质粒pKu 1,转化谷氨酸棒杆菌B4,并得到表达.酶活性测定表明,pfkA基因在受体菌B44中得到表达水平为(128.6±0.86)U/g蛋白,解除了磷酸果糖激酶对已经改造的谷氨酸的整个代谢途径的限制.同时,转化菌对糖转化率比B4高10.64%,产酸率高17.1%.     

凋亡蛋白对Hep2细胞影响的研究

从鸡贫血病毒(CAV———ch icken anem ia virus)总DNA中克隆凋亡蛋白(Apoptin)基因片段,并与pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体构建融合载体,转化E.coli.DH5α,筛选氨苄抗性阳性克隆并鉴定.以该融合载体转染Hep2细胞后,在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光标记,同时观察到细胞核形态学呈凋亡特征变化,表明凋亡蛋白可以诱导Hep2细胞系发生凋亡.     

斑节对虾carcininPm3的表达及其无标签多肽的获得

crustin是对虾中重要的抗菌肽,本研究获得的carcinin Pm3属于斑节对虾crustin家族,是一种新型抗菌肽,成熟肽含有92个氨基酸,与其他对虾抗菌肽的同源性小于45%.根据其氨基酸序列和大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)的密码子偏好性设计carcinin Pm3的基因序列,将carcinin Pm3连接到原核表达载体pSmartI-SUMO上,构建重组表达载体p SmartI-SUMO-carcinin Pm3,再转化至原核表达菌株E. coli BL21 (DE3)中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导SUMOcarcinin Pm3的融合表达,进一步优化其表达条件,获得表达量大、可溶性高的重组蛋白.通过亲和层析纯化得到重组蛋白,蛋白的质量浓度达到195μg/m L.利用SUMO酶去除SUMO融合标签,获得没有外源标签的carcinin Pm3抗菌肽,可用于蛋白功能分析、抗体制备等研究.研究结果为carcinin Pm3功能的分析及应用提供参考.     

海参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及活性鉴定

采用原核宿主大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了具有活性的仿刺参铜锌超氧化物歧化酶(Apostichopus japonicus Cu/Zn-superoxide dismutase,Aj-SOD1)蛋白。利用Trizol法从海参肠组织中提取总RNA,通过反转录PCR扩增获得Aj-SOD1基因的编码序列(GenBank:JX097096.1,459bp),构建克隆载体pMD18-Aj-SOD1;在目的基因两端引入(XhoⅠ/NdeⅠ)酶切位点,构建克隆载体pMD18-AjSOD1(XhoⅠ/NdeⅠ)。将此载体与表达质粒pET30a(+)分别双酶切后连接,构建重组表达载体pET30a-Aj-SOD1。转化至大肠杆菌BL21(DE3),Kan+抗性筛选阳性转化子,获得基因工程菌BL21(DE3)-pET30a-Aj-SOD1。SDS-PAGE和邻苯三酚自氧化法检测发现,经0.1 mmol/L IPTG诱导8h后,成功获得具有抗氧化活性的Aj-SOD1蛋白。     

表达荧光假单胞菌鞭毛蛋白工程菌的构建及其对黑松的毒性

构建了组成分泌表达载体pUC18ompA,将荧光假单胞菌Pf-5鞭毛蛋白的编码基因fliC克隆到pUC18ompA构建pUC18ompA-fliC,重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建了工程菌。工程菌与无菌松材线虫混合接种黑松无菌苗,研究其对无菌苗的致病能力。接种试验结果表明,工程菌与无菌松材线虫混合接种同样可以引起黑松无菌苗的萎蔫。进一步验证了体内荧光假单胞菌鞭毛蛋白在松材线虫病致病过程中的作用。     

重组海参溶菌酶的表达及其性质

研究了重组海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)可溶性表达的发酵条件。采用多因素正交优选法,以摇瓶培养方式从培养基组分、发酵条件两个方面对重组海参溶菌酶进行研究,构建了高效分泌型表达重组海参溶菌酶工程菌。研究结果发现,30℃、140r/min、IPTG浓度0.3mmol/L、诱导后继续培养14h,目的蛋白分泌表达量可达到30~40mg/L,且产物以大量可溶性蛋白存在。     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径,以提高L-组氨酸的产量．用NTG诱变大肠杆菌M-17（SG^r）,依次赋予其2噻唑丙氨酸（2-TA）和组氨酸氧肟酸盐（HisHx）遗传标记,再以突变株M-18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his—operon,将重组质粒导入突变株M—18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）得到工程菌Ecoli M-19（SG^r＋2．TA^r＋HisHx^r／pUC118-his—operon）．根据硝和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E．coli MZH-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L-组氨酸的产量．摇瓶发酵结果显示,L-组氨酸产量与对照株相比,工程菌E．coli M-19提高了4．5倍,双质粒系统重组工程菌E．coli MZH-19、Ecoli MPH-19和E．coil MZPH-19分别提高了5．14、5．78、8．43倍．     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究

为得到具有催化活性的重组亚油酸异构酶,对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株亚油酸异构酶基因进行体外定向进化.经过两轮连续易错PCR扩增及一轮DNA改组获得了突变基因片段,并克隆到pET30a质粒载体上,转化大肠杆菌,构建了该酶的基因突变文库.经IPTG诱导表达后筛选出一株重组菌,可表达可溶性重组酶蛋白,经紫外分光光度计法测定,重组酶蛋白活力为8.2 U.     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

融合蛋白sCAR-TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1(TSP-1)氨基酸序列(RFYVVMWK),以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR-TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

融合蛋白sCAR—TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1（TSP-1）氨基酸序列（RFYVVMWK）,以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR—TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

阿魏酸酯酶基因工程菌发酵条件优化

以本实验室前期构建的重组大肠杆菌工程菌株为基础,为提高阿魏酸酯酶的表达量,通过试验设计,对工程菌株目的蛋白可溶表达条件进行优化。实验采用250 mL三角瓶中,内含50 mL(Amp 100 mg/L)的LB培养基,分别研究诱导温度、诱导物IPTG浓度、诱导时机和诱导时间等对蛋白可溶表达量的影响。确定了阿魏酸酯酶工程菌可溶性表达最优条件为:过夜培养菌体以1∶100比例接种新鲜培养基,摇床转速200 rmp/min,在37℃下培养至OD600值为1.0时,添加终浓度为0.01 mM的IPTG进行诱导,诱导温度30℃,诱导时长为9 h,最终单位发酵液的酶活力为400 U/L。以上数据为阿魏酸酯酶重组工程菌的工业应用奠定了基础。     

大肠杆菌中可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21及制备

为在大肠杆菌中高效、非融合、可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF-21),研究了纯化方法,以获得具有较高生物活性的rhFGF-21。全基因合成人成纤维细胞生长因子21cDNA序列,克隆进原核表达载体pET-3c,在转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中进行表达。表达产物经盐析、层析等方法纯化后,利用3T3-L1细胞鉴定其促葡萄糖摄取的生物学活性。结果表明:rhFGF-21在BL21(DE3)PlysS实现了高效、非融合、可溶性表达,目的蛋白占菌体总蛋白的20%左右;表达产物经纯化后,纯度可达95%以上;表达产物能够明显促进3T3-L1细胞对葡萄糖的吸收。该方法成功实现了rhFGF-21在大肠杆菌中高效可溶性表达。