贻贝盐溶蛋白特性分析及其ACE抑制肽的酶法制备

以贻贝为原料提取盐溶性蛋白,首先研究盐溶性蛋白的分子质量分布、粒度分布和变性温度等性质,然后比较其3?种蛋白酶（胰蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶）酶解产物的血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制活性,筛选出ACE抑制活性较高的胰蛋白酶酶解物,其IC50值为215.96?μg/mL。利用质谱对胰蛋白酶酶解物中的多肽氨基酸序列进行鉴定,利用多肽序列与ACE的对接分数初步筛选出11?个分值大于180?分的多肽序列,通过氨基酸组成结合情况和两者间氢键等相互作用,进一步筛选活性肽并阐述抑制活性机理,最终推测出LYDIDVAK和WIAEEADK是活性较高的抑制肽。     

α-乳白蛋白源ACE抑制肽快速筛选及验证

采用生物信息学手段，利用在线工具对α-乳白蛋白进行虚拟酶解，通过对活性肽的活性、毒性及理化性质进行预测，并结合分子对接的方法实现快速精准筛选新的血管紧张素转化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制肽Pro-Glu-Trp（PEW）。通过固相合成法制备出活性肽PEW进行体外活性验证，其半抑制浓度（IC50）为3?130?μmol/L。全柔性分子对接模拟结果表明，PEW与ACE活性口袋S1相互作用可能是其具有ACE抑制活性的主要原因，氢键、疏水作用力、静电力是维持两者结合的主要作用力。与传统方法相比，本研究可以快速高效地筛选出ACE抑制肽，为食源性活性肽的快速筛选提供了新思路。     

马氏珍珠贝来源DPP-IV抑制活性肽的虚拟筛选及其作用机制

为了快速发现马氏珍珠贝来源二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制活性肽,本研究利用数据库中20个已报道的DPP-IV抑制肽组成训练集,构建了药效团模型并通过测试集分子和Fisher随机验证法对模型进行了评估。利用在线网站PeptideCutter,以珍珠贝肉蛋白为原料,进行虚拟酶解。使用最优药效团模型（Hypo1）对虚拟酶解获得的192个低分子肽（氨基酸数小于或等于5）进行初步筛选,接着以分子对接的方法进一步筛选,并且对潜在的DPP-IV抑制活性肽进行固相合成,体外验证其活性并分析其作用机制。结果表明,药效团结合分子对接技术筛选了4个理论上可能具有高活性的DPP-IV抑制肽,即LPIY、VQDR、PIY和APSL。其中,VQDR、PIY没有表现出抑制活性,而LPIY和APSL具有较高的DPP-IV抑制活性,其IC₅₀值分别为521.19 和258.67 μmol/L。与DPP-IV相互作用的机理表明,肽LPIY和APSL与DPP-IV活性口袋中的氨基酸残基形成了多个氢键,且N-端第二个位置的脯氨酸（P）也均与活性口袋中的残基形成了Pi-Alkyl作用,因此促进了LPIY和APSL的DPP-IV抑制作用。本研究为高效筛选珍珠贝来源的DPP-IV抑制肽提供了理论方法。     

基于分子对接虚拟筛选含酪氨酸残基的ACE抑制三肽

为获得含酪氨酸残基的ACE抑制三肽,借助在线Novopro数据库构建C端为酪氨酸的三肽进行虚拟筛选,得到具有ACE-C结构域选择性抑制的三肽,预测其生物活性、水溶性、肠胃吸收性、代谢和毒性等性质,运用分子对接计算出与血管紧张素转化酶（angiotensin-? converting enzyme,ACE）具有高度亲和力的四种ACE抑制肽RWY、FRY、YRY和RFY并进行体外ACE抑制活性测定,探讨结合位点与作用关系。结果表明,经筛选得到的四种三肽RWY、FRY、YRY、RFY具有明显的ACE抑制活性,IC₅₀值分别为228.67、113.10、272.61、101.00 μmol/L。分子对接虚拟结果显示,RWY、FRY、YRY、RFY均与S₁′口袋高度亲和,产生氢键相互作用,其中与S₁′口袋结合产生2条氢键的RFY的抑制效果最佳。本文利用生物信息学原理,针对性筛选ACE-C结构域选择性抑制的酪氨酸三肽,为ACE抑制肽的高速筛选提供新的可能性。     

驼乳乳铁蛋白DPP-IV抑制肽的筛选验证及其防治糖尿病潜在作用机制探究

目的:结合生物信息学,从驼乳乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）中筛选DPP-IV（Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制肽,并利用网络药理学探讨筛选肽段对糖尿病的潜在作用机制。方法:利用BIOPEP网站模拟酶切LF序列产生多条肽段,结合多肽数据库及分子对接筛选潜在的DPP-IV抑制肽,选择其中四条进行人工合成,验证其DPP-IV抑制活性,通过分子对接分析肽段与DPP-IV分子间相互作用方式,Lineweaver-Burk方法分析肽段抑制模式。选择抑制作用较强的GPQY进行网络药理学分析,预测其对糖尿病的潜在作用机制。采用Swiss Target Prediction和GeneCards数据库挖掘GPQY及糖尿病的作用靶点,String数据库获取蛋白与蛋白互作关系,Cytoscape 3.9.0软件构建PPI网络,DAVID数据库对靶点进行GO与KEGG通路富集分析。结果:筛选验证获得2条DPP-IV抑制GPQY和EACAF,其半抑制浓度（IC₅₀）值分别为348.27±16.11和1024.89±19.67 μmol/L,抑制模式分析表明GPQY为竞争性抑制,EACAF为混合型抑制。分子对接结果显示两条肽段通过氢键、疏水作用和静电作用与DPP-IV结合。由PPI网络筛选到GPQY有STAT3、MMP9、SRC、MAPK1等25个核心作用靶点,KEGG通路富集显示GPQY防治糖尿病通路涉及IL-17信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、肾素-血管紧张素系统、细胞凋亡等。 结论:驼乳LF是DPP-IV抑制肽的良好来源,由其获得的四肽GPQY可通过多靶点、多通路参与炎症反应,影响细胞增殖分化等多方面防治糖尿病及其并发症。     

基于分子模拟技术筛选牛乳清蛋白源抗氧化肽

传统抗氧化肽的筛选往往需要经过酶解、纯化、分离、鉴定及体外试验验证,时间和物力花费较大。本研究以生物信息学为理论基础,利用计算机虚拟消化、相关活性预测与评价、药物代谢动力学及分子模拟技术对牛乳清蛋白源抗氧化肽进行依次筛选,对其可能发生的Keap1-Nrf2-ARE抗氧化途径进行分析、解释,分析其分子反应过程中构象的稳定性。应用PeptideRanker程序对生物活性进行预测评分,筛选得到137条评分大于0.4的肽段,同时采用ToxinPred、Innovagen、Expasy-compute及Pepdraw程序进一步分析肽段的理化性质,并通过药物代谢动力学ADMET、TOPKAT分析对肽段进行筛选,得到14条无毒、无致敏性、无致突变性、无致癌性及水溶性良好的多肽,然后将其与Keap1受体进行分子对接。将分子对接评分前4位的多肽与Keap1的最优结合复合物进行构象作用机制分析,最终通过复合物构象分子间作用力评价CDEF序列最具抗氧化活性的潜力,并将CDEF-Keap1受体复合物进行分子动力学模拟,结果显示动力学模拟过程中构象变化较稳定,因此CDEF抗氧化肽可在人体中较好地发挥抗氧化活性。...     

仿刺参胶原蛋白源二肽基肽酶抑制肽虚拟筛选及分子对接研究

目的 采用生物信息学和分子对接方法筛选仿刺参胶原蛋白来源的二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)抑制肽。方法 以仿刺参胶原蛋白序列为对象,进行生物信息学分析和计算机辅助虚拟酶解,基于生物毒性、致敏性、水溶性及吸收、分配、代谢、排泄及毒性(absorption,distribution,metabolism,excretion,toxicity,ADMET)预测,筛选得到6条具有潜在生物活性的寡肽,氨基酸序列分别为CD、CQ、CS、GR、SM、MDG,进一步通过分子对接分析肽段与DPP-Ⅳ的结合活性,并分析其结合位点及方式。结果 生物信息学分析表明仿刺参胶原蛋白是生物活性肽的潜在优良来源,经木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶及模拟胃肠道虚拟水解后能够释放出DPP-Ⅳ抑制肽;分子对接表明俩条新肽段CS、SM通过氢键、疏水相互作用分别与DPP-Ⅳ的S1、S2活性口袋结合。结论 本研究提供了一种快速筛选刺参胶原蛋白中DPP-Ⅳ抑制肽的方法。     

豆粕血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定及作用机制解析

以大豆粕为原材料,利用超声辅助酶解技术、超滤-?KTA层析相结合的方法分离纯化获取豆粕酶解产物中血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制肽,对其分子质量分布进行研究,后通过质谱分析与分子对接技术鉴定并筛选出ACE抑制活性肽的氨基酸序列,经固相合成肽序列,检测其ACE抑制肽的活性并基于分子对接技术探索其抑制机制。结果表明：经超声辅助酶解提取获得的豆粕肽分子质量主要分布在6 000 Da以下;根据分子对接的最低预测自由能筛选出的GVRP（－8.44 kcal/mol）和IIVTP（－9.04 kcal/mol）可以抑制ACE活性,半抑制浓度（50% inhibitory concentration,IC50）分别为（84±0.06）、（77±0.08）μmol/L;分子对接结果表明：GVRP、IIVTP能够与ACE的活性口袋S1、S1′、S2形成氢键相互作用,共有的过近接触（3.5 ?范围内）ACE氨基酸残基为His513、Ala354和Glu384。本研究基于串联质谱与分子对接技术,建立从混合多肽中快速鉴定、筛选活性多肽的方法,探究活性多肽与ACE稳定结合并体现其ACE活性的抑制机制,为后续的深入研究提供一定参考。     

白啤中二肽基肽酶-IV抑制肽的虚拟筛选及活性分析

以青岛白啤作为研究对象,建立一种快速筛选二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV）抑制活性肽的方法。白啤经超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱结合De novo软件鉴定出肽段序列,确定了置信度较高的68 条肽段。应用Peptide Ranker对68 条肽段进行生物活性评分,筛选出评分大于0.5的4 条肽段,同时又根据先前文献对抑制DPP-IV活性肽的氨基酸位点研究报道,筛选出13 条肽段。对筛选出的17 条肽段进行吸收、代谢及毒性预测及分子对接评价,选定了VPFPHTP和LAKLQR两条潜在抑制DPP-IV活性肽段。通过肽段与DPP-IV分子对接构象图表明,选定的2 条活性肽均能以氢键及疏水作用紧密结合DPP-IV,从而抑制其活性。利用体外方法验证2 条活性肽抑制DPP-IV活性,结果显示2 条肽段具有明显的DPP-IV抑制活性。     

酶解法制备绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽的工艺优化及其抑制机制

为优化酶解法制备绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽的工艺条件以及筛选和鉴定一种新的ACE抑制肽,选用5种蛋白酶水解酪蛋白,以水解度、分子质量分布和ACE抑制率为指标筛选最适蛋白酶,采用单因素和响应面试验优化工艺,采用三合一质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS)方法鉴定分子质量小于3 ku组分的氨基酸序列,筛选潜在ACE抑制肽,进行人工合成,测定其IC50值。采用Linewaver-Burk作图确定酶抑制动力学,结合分子对接解析肽段的抑制机制。结果表明:碱性蛋白酶水解酪蛋白的最佳条件为pH 6、底物含量8%、酶添加量4%、温度55 ℃、水解时间90 min,此时酪蛋白水解液ACE抑制率为99.1%。验证具有ACE抑制活性的肽段10条,筛选出一条新颖的降血压肽——LFRQFY(源自αs1-酪蛋白),其ACE抑制活性的IC50为(7.9±1.7)μmol/L,酶抑制动力学为混合抑制模式。分子对接结果表明:LFRQFY能与ACE的氨基酸残基Ala354(活性口袋S1)、His353(活性口袋S2)形成氢键,具有显著的体外降血压活性。     

一种新型绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽结构鉴定及分子结合机制分析

本研究旨在利用蛋白酶水解绵羊乳酪蛋白,制备新型血管紧张素转化酶（Angiotensin-I-Converting Enzyme,ACE）抑制肽并对其分子抑制机制进行分析,为功能性绵羊乳多肽乳制品开发提供技术支持。试验以绵羊乳酪蛋白为原料,以水解度、ACE抑制率和分子量分布为评价指标,从四种蛋白酶中筛选最适蛋白酶,选择<3 kDa的组分通过LTQ Orbitrap Velos质谱仪进行肽鉴定,筛选潜在的ACE抑制肽进行人工合成并测定其半抑制浓度（IC₅₀）,采用Linewaver-Burk作图确定酶抑制动力学,结合分子对接进一步解释肽段的抑制机制。结果表明:碱性蛋白酶为最佳水解蛋白酶;从κ-酪蛋白中筛选出一种新的ACE抑制肽KYIPIQY,半抑制浓度（IC₅₀）为5.73 μmol/L;Linewaver-Burk图表明该肽对ACE为混合型抑制模式;分子对接显示,KYIPIQY通过与ACE的S1和S2活性口袋形成氢键和疏水作用力发生紧密结合并且可以扭曲ACE的Zn2+四面体,抑制ACE催化活性的失活而发挥高效的ACE抑制活性。     

基于分子对接技术研究鱼源抗冻多肽与鱼肌球蛋白的相互作用

冻藏期间蛋白质冷冻变性是引起解冻后鱼糜凝胶化能力下降的主要原因之一,而肌球蛋白重链（Myosin Heavy Chain,MHC）是鱼糜凝胶形成的主要贡献者。本研究使用不同生物酶酶解制备抗冻多肽,通过计算机模拟酶解技术筛选抗冻多肽。利用蛋白质同源建模构建海鲈鱼肌球蛋白空间结构,通过分子对接和分子动力学模拟解析抗冻多肽与海鲈鱼肌球蛋白重链的作用位点及可能的作用机制。结果表明,胰蛋白酶酶解物具有高抗冻活性,对菌体低温胁迫保护达到80.35%±4.39%,并具有良好的热滞活性及抑制重结晶作用。模拟胰蛋白酶酶解获得的肽段GPR与GPAGGK可以与肌球蛋白重链通过分子间作用力结合,其中GPAGGK的结合更为稳定。这种相互作用可以阻碍肌球蛋白在温度变化中的结构改变,其机理可能是抗冻多肽结合在肌球蛋白重链的结构空腔上,影响了结合水解离后引起的疏水键及二硫键等化学键的形成,阻碍蛋白侧链聚集、结构改变和冰晶的位移等,这有利于鱼糜及鱼糜制品在冷冻贮藏中的品质保持。本研究结果为抗冻多肽应用于鱼糜及其制品在冷冻贮藏过程中品质保持的应用提供科学依据。     

马氏珍珠贝肉蛋白水解特征及其ACE抑制肽的筛选

为探索马氏珍珠贝肉的水解规律及快速鉴定血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制活性肽,本研究以不同时间(2、4、6、8、10h)的酶解物为对象,采用三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、分子质量分布、反相高效液相色谱(reversed-phase high...     

酶解大豆分离蛋白的抗原活性变化及其抗原表位分析

研究酶解过程中大豆蛋白分子成分和抗原性变化规律及酶解物中是否存在抗原表位序列。用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白后,首先分别用电泳和酶联免疫法分析蛋白质分子组分和抗原活性变化,结果发现,酶解过程中新生成23 ku和21 ku抗酶解肽链直到酶解120 min时仍未消失,同时酶解物中剩余28%抗原活性。进一步通过胰蛋白酶对这两个肽链胶内酶解并用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪分析后,将所得肽段氨基酸序列分别与抗原数据库中抗原表位序列和大豆分离蛋白氨基酸序列进行匹配解析,结果发现,在21 ku组分中含有两个完整的序列抗原表位（LQRFNQRSPQLQNLR和SEDKPFNLRSRDPIYSNKLGKFFEITPEKN）,且均来自β-伴大豆球蛋白中的α-亚基,21 ku组分抗原剩余率为15.7%;在23 ku肽链中含有抗原表位的部分氨基酸序列,但未发现含有完整的抗原表位序列,23 ku组分抗原剩余率为2.1%,该组分中是否含有新的未知抗原表位或是否与糖链有关尚待深入研究。上述研究结果揭示了大豆蛋白酶解物中仍残留抗原性的部分原因。     

荞麦抗感染多肽研究进展

近年来,国内外学者在荞麦种子内发现了很多抗菌肽、抗肿瘤多肽以及胰蛋白酶抑制剂等抗感染多肽,这些多肽的结构特征和实际应用的研究越来越受关注。主要综述了荞麦抗感染多肽的分子结构特征,抗菌、抗肿瘤、胰酶抑制等生理活性及其作用信号机制等方面的研究进展。     

源于皱纹盘鲍裙边胶原蛋白ACE抑制肽的制备

为了提高皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)裙边的利用率,以其为原料纯化胶原蛋白,并通过胰蛋白酶和胃蛋白酶共酶解制备血管紧张素转换酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽。酶解液经超滤、Superdex^TM peptide10/300GL凝胶柱和高效液相色谱分离纯化,获得了3条来源于皱纹盘鲍胶原蛋白的肽段SGEVGQ、QRGPAGAQGPQ和GPPGPAGAR。其中结合能力最强的肽为GPPGPAGAR,对ACE的IC50值为177.1μmol/L,分子对接结果显示其主要作用于ACE的S1活性口袋,抑制模式与赖诺普利类似,并且经模拟胃肠液消化后仍能发挥较强的ACE抑制作用。本研究通过酶解皱纹盘鲍裙边胶原蛋白制备ACE抑制肽,为鲍鱼裙边的精深加工和ACE抑制肽的开发提供了参考。     

计算机辅助的蛋白质降血压活性评估方法

目的 借助虚拟水解与分子对接软件, 建立蛋白质降血压活性评估函数。方法 采用Autodock软件将胃肠道蛋白酶水解可能产生的二、三肽与血管紧张素I转化酶(angiotensin I-converting enzyme, ACE)进行分子对接, 根据对接能量值对短肽的ACE抑制活性进行预测, 并对肽的结构特征进行了详细地分析和统计。基于肽段与ACE结合的能量值建立可评估食品蛋白质降血压活性(G值)的打分函数, 并对22条已知氨基酸序列的可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)蛋白质的降血压活性进行评估。结果 对于二、三肽, 由带电荷的氨基酸、芳香族氨基酸和脯氨酸组成的肽段更易与ACE结合, 此外, 酸性氨基酸(带负电荷)所组成的肽段也易与ACE结合。采用打分函数对22条可口革囊星虫蛋白质的降血压活性进行评估, 其中19条蛋白质具有较好的降血压活性。结论 可口革囊星虫是一种良好的降血压肽来源, 计算机辅助的基于对接能量值的ACE抑制活性预测以及打分函数建立对生物活性肽的研究具有重要的参考价值。     

Non-SELEX method for aptamer selection against β-casomorphin-7 peptide

The non-systematic evolution of ligands by the exponential enrichment (non-SELEX) method was used in the present study for the selection of β-casomorphin-7 (BCM-7)-specific aptamers. These aptamers were tested to evaluate their ability to detect BCM-7 peptide in the human urine sample. The method did not employ aptamer amplification and counterselection as used in conventional SELEX but included a negative round of selection. The selection was performed in a single day, and after 5 rounds, a total of 16 numbers of aptamer were identified through Sanger sequencing. Newly selected aptamers named sequence ID no. 3 have performed better than other aptamers in detecting the BCM-7 peptide. Sequence ID no. 3 was also compared with previously selected aptamers through the SELEX method and its performance was found to be better than old aptamers. The sensing experiment was tried on different platforms from magnetic beads to the membrane. In each strategy, satisfactory results were obtained with aptamers that recognized BCM-7 spiked in a human urine sample at a very low amount. The non-SELEX method is an easy and time-saving process for aptamer selection. Selection of viable aptamers from a large pool of sequences for sensing experiments is a tedious job; however, an attempt has been made to select aptamers on the basis of In Silico (http://www.unafold.org/, https://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/index.php) information, observing DNA band intensity on agarose gel and colorimetric results obtained on magnetic beads and membrane. These aptamers have the potential in biosensor making for detecting BCM-7 peptide in urine samples of autistic patients.     

Identification and molecular docking study of novel cholesterol esterase inhibitory peptides from camel milk proteins

Novel bioactive peptides from camel milk protein hydrolysates (CMPH) were identified and tested for inhibition of cholesterol esterase (CEase), and their possible binding mechanisms were elucidated by molecular docking. Papain-generated CMPH showed the highest degree of hydrolysis. All CMPH produced upon enzymatic degradation demonstrated a dramatic enhancement of CEase inhibition compared with intact camel milk proteins, with papain-generated hydrolysate P₉ displaying the highest inhibition. Peptide identification and their modeling through PepSite 2 revealed that among 20 potential bioactive peptides in alcalase-generated hydrolysate A₉, only 3 peptides, with sequences KFQWGY, SQDWSFY, and YWYPPQ, showed the highest binding toward CEase catalytic sites. Among 43 peptides in 9-h papain-generated hydrolysate P₉, 4 peptides were found to be potent CEase inhibitors. Molecular docking revealed that WPMLQPKVM, CLSPLQMR, MYQQWKFL, and CLSPLQFR from P₉ hydrolysates were able to bind to the active site of CEase with good docking scores and molecular mechanics–generalized born surface area binding energies. Overall, this is the first study reporting CEase inhibitory potential of peptides generated from milk proteins.