海洋菌株Mitsuaria sp. SH-50产嗜热性壳聚糖酶CsnSH50的酶学性质表征及其应用

实验室从中国海南滨海虾蟹养殖区泥土样品中筛选到一株高产壳聚糖酶的海洋菌株Mitsuaria sp. SH-50,优化后该菌株产酶时间仅为12 h,产酶活性可达26.6 U/mL。该研究对其胞外壳聚糖酶进行分离纯化和酶学性质表征并进行壳寡糖制备的小试放大试验,以期进一步明确该菌株在壳寡糖生产上的实际意义。结果表明：壳聚糖酶CsnSH50分子量约为41 ku,纯化后CsnSH50比酶活力为7 462.50 U/mg,最适反应pH值为4.5,温度为75 ℃,在pH值2.5~8.5及温度低于50 ℃条件下稳定性较好。最适条件下,稀释后CsnSH50的最大反应速率Vmax=29.41 U/mL,米氏常数Km=1.71 mg/mL,1 mmol/L的K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+对CsnSH50的酶活力有明显正激活效应,10 mmol/L的Mn2+对其正激活效应可达412%。TLC和ESI-MS结果表明：CsnSH50水解壳聚糖的最终产物主要为壳二糖、三糖、四糖。小试放大试验结果显示：制备5%（m/V）壳寡糖溶液时,壳聚糖溶液的初始pH值3.5,温度75 ℃,水解120 min时壳寡糖产率达到92.1%,产物平均聚合度为10.2。综上,CsnSH50具有酶活性高、热稳定性好、耐酸等特性,同时是一种鲜有报道的嗜热性壳聚糖酶,具有良好的工业应用潜力。     

毕赤酵母表达解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶及其水解制备可控结构壳寡糖

优化并全合成解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）壳聚糖酶编码基因并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现分泌表达,表达产物的蛋白质量浓度达到0.23 mg/mL。壳聚糖水解酶的最适pH值为5.0,最适温度为45 ℃,比活力达52.2 U/mL。该酶在50 ℃以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物进行了组成及结构分析。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度3～15、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振鉴定结果显示,壳寡糖组分的还原末端及非还原末端均主要由氨基葡萄糖组成。综上,本研究高效表达了来源于解淀粉芽孢杆菌的壳聚糖酶,并制备了确定末端结构的壳寡糖,为壳寡糖的结构与功能关系研究提供理论支持。     

萎缩芽孢杆菌Rk1壳聚糖酶高效制备及特性表征

壳聚糖酶在壳寡糖酶法制备过程中发挥重要作用,高效制备壳聚糖酶为其产业化应用奠定基础。采用同源克隆获得萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)Rk1壳聚糖酶基因(bacsn46)。将密码子优化和分子伴侣蛋白共表达进行结合,实现萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶(BaCsn46)高效表达。通过表征分析获得重组BaCsn46酶学特性。bacsn46基因全长825个碱基,编码274个氨基酸,其中前32个氨基酸为信号肽序列。在7 L发酵罐条件下,重组菌最高发酵酶活力和总蛋白质量浓度分别达到7 356 U/mL和5.95 g/L。重组BaCsn46最适反应温度和pH分别是60℃和6.0,金属离子Mg²⁺和Mn²⁺对重组BaCsn46具有激活作用,重组BaCsn46最小和最适水解底物分别是壳四糖和95%脱乙酰度胶体壳聚糖。此外重组BaCsn46能够高效水解不同浓度胶体壳聚糖,制备不同聚合度壳寡糖。     

耐盐芽孢杆菌R1高效壳聚糖酶异源表达及特性分析

采用同源克隆获得耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶基因,并异源表达制备重组耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶（CsnBh46）,通过表征分析获得重组CsnBh46酶学特性。重组CsnBh46全长278个氨基酸,三维结构显示其分为上下两个半球,包含9个α螺旋和2个β折叠。在7 L发酵罐中,重组工程菌bh-5的最高酶活力和总蛋白质质量浓度分别为6 375 U/mL和4.3 g/L。纯化后的重组CsnBh46最适反应pH和温度分别为6.0和60 ℃,金属离子Mn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺对重组CsnBh46具有激活作用。重组CsnBh46最适底物为脱乙酰度95%胶体壳聚糖。重组CsnBh46能够高效水解胶体壳聚糖并且根据反应时间可以定向制备不同聚合度壳寡糖。本研究为CsnBh46产业化应用奠定基础。     

南极磷虾壳聚糖、壳寡糖的制备与品质鉴定

本研究以南极磷虾壳为原料,制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,并对二者的品质进行鉴定。南极磷虾壳经脱钙、脱蛋白处理,探索脱乙酰反应条件（碱溶液浓度、反应温度与反应时间）,制备具有较高脱乙酰度的南极磷虾壳聚糖,并对壳聚糖的理化指标进行鉴定;探索酶法降解条件（壳聚糖酶添加量、酶解时间）,制备较高纯度的南极磷虾壳寡糖,并对壳寡糖的结构特征进行鉴定。结果表明,使用60%的氢氧化钠于110 ℃脱乙酰处理4 h制备的南极磷虾壳聚糖脱乙酰度为85.74%,粘均分子量为 305.65 kDa,水分含量4.66%,灰分含量0.98%,酸不溶物含量0.40%,各项理化指标均符合食品级壳聚糖的要求;使用壳聚糖酶水解南极磷虾壳聚糖制备壳寡糖,在壳聚糖酶添加量为0.2% （m/V）,酶解16 h条件下,南极磷虾壳寡糖产品得率为46.0%,红外光谱与NMR谱图显示了表征壳寡糖结构的全部特征峰,质谱结果显示南极磷虾壳寡糖主要由二糖(GlcN)₂、三糖(GlcN)₂-GlcNAc与四糖(GlcN)₃-GlcNAc构成。本研究通过制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,为南极磷虾壳的高值综合利用与南极磷虾新产品开发提供了技术支持。     

响应面法优化微波辅助果胶酶制备壳寡糖的工艺

为优化壳寡糖制备工艺,提高壳寡糖得率,以壳聚糖为原料,采用微波法辅助果胶酶酶解壳聚糖制备壳寡糖,以还原糖含量作为壳寡糖的产率依据,通过单因素实验和响应面实验确定最佳工艺条件为:果胶酶加酶量2100 U/g,微波功率510 W,pH4.4,反应温度50℃,在此工艺条件下获得的降解产物中还原糖浓度为1.964 mg/mL,与单一果胶酶酶解法(1.747 mg/mL)相比提高了12%,与单一微波法(1.671 mg/mL)相比提高了18%。     

壳聚糖酶的基因克隆表达及酶学性质研究

作者从NCBI数据库中挖掘到来源于Butyrivibrio sp. MC2013的壳聚糖酶基因,命名为BUT,该壳聚糖酶基因大小为903 bp,编码301个氨基酸。通过NCBI数据库和进化树比对发现,该壳聚糖酶（BUT）属糖苷水解酶46家族（后简称GH-46）,与其它壳聚糖酶相似度为59%,是一种新型的壳聚糖酶。序列经密码子优化后进行全基因序列合成,与表达载体pET21a（+）连接构建重组质粒pET-21a-BUT,转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）表达宿主,进行诱导表达。所得重组壳聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,SDS-PAGE确定其蛋白分子量为35 kDa,DNS法测定其酶活为146.0 U/mg。对BUT酶的酶学性质进行探究,结果表明BUT酶最适温度和pH分别为45 ℃、8.0,在中性偏碱性条件下稳定性较强。Mn2+对其酶活力具有促进作用,SDS、Fe3+、Cu2+、Zn2+等的抑制作用极强。通过TLC对其水解产物分析发现,BUT水解壳聚糖的产物是壳二糖、壳三糖和壳四糖。     

响应面法优化组成型壳聚糖酶酶解条件

以壳聚糖为原料,通过蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）发酵所得壳聚糖酶水解壳聚糖产生壳寡糖,对酶解pH、温度、底物浓度和时间分别进行单因素试验,并在此基础上,通过响应面法研究这4种因素对壳寡糖产量的影响,优化酶解条件。结果表明,壳聚糖酶酶解的最佳条件为pH值5.6,酶解温度53 ℃,壳聚糖质量分数2.09%,酶解时间157 min。在该优化条件下,壳寡糖的浓度为35.73 μmol/mL,与模型预测值35.476 μmol/mL接近,则该模型可用于优化壳聚糖酶酶解条件。     

高浓度壳聚糖溶液酶解条件优化

在研究了壳聚糖酶的温度和pH稳定性的基础上,通过在溶解过程中加酶对高浓度壳聚糖溶液酶解条件进行优化,考查了加酶时间及加酶量对8%壳聚糖溶液酶解效率和酶解液粘度的影响,并对优化前后目标溶液中几种壳寡糖的含量进行分析。结果表明:壳聚糖酶在45~55℃及pH4.5~5.5范围内保持稳定;对8%壳聚糖溶液体系,在滴加盐酸浓度达到0.17 mol/L时,加入2 U/g壳聚糖的酶液,当盐酸浓度达到0.48 mol/L时再补加3 U/g壳聚糖的酶液,这种方案可以有效降低体系粘度并保持酶活力;薄层色谱和高效液相色谱分析结果表明,通过以上方式的优化,聚合度2~6的壳寡糖总含量及壳五糖和壳六糖的含量均显著增加(p<0.05),分别达到42.7、5.5和3.9 mg/mL,大大提高了生产效率和降低浓缩成本。     

内切壳聚糖酶在食品级壳寡糖酶法生产中的应用

研究1株曲霉JXSD-01发酵液中内切壳聚糖酶(eCSN)的纯化与功能,以寻求一种清洁的生产不含单糖的壳寡糖的方法。经分析,不含外切酶活性的eCSN蛋白酶比活力＞50U/mg,分子质量为25kD,酶的最适温度为63℃,最适pH6.5。经N末端测序,内切壳聚糖酶的N端序列为YNLPNNLKQ。eCSN用于天然大分子壳聚糖的生物降解,可获得分子质量在1000～3500D的寡糖聚合物,其中无单糖污染,达到国际食品级壳寡糖质量标准。     

Production of high degree polymerized chitooligosaccharides in a membrane reactor using purified chitosanase from Bacillus cereus

Crude chitosanase from Bacillus cereus NTU-FC-4 was separated by a cation exchanger to three fractions named CBCI, CBCII, and CBCIII. The CBCI hydrolyzed chitosan to yield dimers. The primary hydrolytic products of CBCII were low degree polymerized (DP) chitooligosaccharides. The CBCIII had the fastest reaction rate and yielded high DP chitooligosaccharides (heptamer and higher DP oligomers). When CBCIII was used in the ultrafiltration membrane reactor with enzyme/substrate ratio 0.06 unit/mg and 100 min of residence time (RT), the concentration of high DP oligomers was 9.78 mg/mL which occupied ca. 48% of total oligomers in the final product as compared to ca. 29% resulted from the crude enzyme. Decrease of RT to 50 min and 33 min, the high DP oligomers in the products were ca. 61% and 69%, respectively. This system could be operated for at least 24 h and kept a constant permeate flux and product output rate.     

假单胞菌H3壳聚糖酶的纯化及部分酶学性质

对 Pseudmona sp.H3产生的壳聚糖酶粗酶液采用(NH_4)_2SO_4盐析、Sephadex G-25脱盐、Sepharose Q-XL阴离子交换层析和Superdex G-75分子筛层析进行纯化,经SDS-PAGE鉴定为单蛋白带,分子质量约为33.8ku,酶反应最适温度为40℃,最适pH为5.0,降解壳聚精(D.A.90.14％)Km值为3.59g/L,V_(max)值为 3.80mmol/(L·min);Ba~(2+)、K~+、Co~(2+)对该酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Al~(3+)、Cu~(2+)则对酶有抑制作用;此外,该酶除了能降解壳聚糖以外,还具有CMCase活性。     

新食品原料壳寡糖的酶法生产研究

目的针对高分子原料壳聚糖在食品工业应用中的两大难题——清洁生产与安全食用,研究了内切壳聚糖酶EC.3.2.1.132在新食品原料壳寡糖工业生产中的应用。方法通过广泛筛查,选育产酶活性高、性能稳定、具有单一内切模式的野生菌种。综合应用生物工程技术构建高效表达的基因重组工程菌,经优化发酵条件、建立简易纯化方法,获得了专一性内切壳聚糖酶。采用循环型清洁生产工艺用于新食品原料壳寡糖的工业化生产。结果从产酶量10 U/mL左右的野生型曲霉菌株Jxsd-01获得成熟基因,构建重组毕赤酵母工程菌表达体系,内切壳聚糖酶蛋白产量达到0.95 g/L。采用循环型清洁生产工艺酶法生产的壳寡糖含量高达98%,聚合度n=2~10,原料转化率95%以上,生产过程中无废水、废渣产生。结论内切壳聚糖酶应用于食品工业,实现新食品原料壳寡糖的工业化酶法生产,达到清洁、安全、高效的效果,具有应用推广的价值。     

鸡胸软骨Ⅱ型胶原免疫活性肽的制备及其性质

以水解度为指标,优化了中性蛋白酶酶解鸡胸软骨Ⅱ型胶原的条件,在此基础上制备不同水解度Ⅱ型胶原酶解复合物,并以淋巴细胞增殖率为指标对其免疫活性进行研究。结果表明,中性蛋白酶的酶解能力最强,其最佳酶解条件为：酶解温度50 ℃、pH 7.5、底物质量浓度25 mg/mL、加酶量40 U/mg、酶解时间150 min。当Ⅱ型胶原在水解度为18%时,其对淋巴细胞的增殖活性达到58.69%。Ⅱ型胶原酶解复合物的质量浓度对淋巴细胞的增殖率也有显著影响,当其质量浓度达到1 mg/mL时,对淋巴细胞增殖能力达到最大。免疫活性较高的Ⅱ型胶原酶解复合物的分子质量主要分布于1 000～180 D范围内,占其总含量的75.21%。     

壳聚糖酶高产菌株选育及发酵条件研究

以自筛曲霉CJ2 2 -3为出发株 ,经紫外线和6 0 Co诱变处理 ,获得 1株壳聚糖酶高产菌株CJ2 2 -3 2 6,经正交实验初步优化了其液态产酶培养基 :壳聚糖 1 5 % ,麸皮 2 % ,(NH4 ) 2 SO4 0 2 % ,KH2 PO4 0 2 % ,MgSO4 0 0 5 % ,Tween -80 0 0 5 % ,pH5 5。优化的发酵条件为 :装液量 75mL/ 2 5 0mL三角瓶 ,摇床转速 1 5 0r/min ,发酵温度为 3 0℃ ,发酵时间为 96h。在此条件下 ,CJ2 2 -3 2 6产酶活力为3 0 6U/mL。     

嗜热杜邦菌α-淀粉酶的定向进化及高效表达

目的:对嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶进行分子改造,以提高其耐热性和产酶水平。方法:基于易错PCR技术构建嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶（Td-amy）的随机突变文库,高通量筛选耐热性和比酶活提高的突变体,通过定点突变及同源结构模拟对突变体进行分析,并将其在毕赤酵母中表达。结果:筛选得到一个正向突变体（mTd-amy）。该突变体最适温度（60 ℃）较野生型（55 ℃）提高了5 ℃,比酶活（466.3 U/mg）较野生型（227.9 U/mg）提高至2.0倍。经序列对比,mTd-amy有四个氨基酸发生了变化,分别为Ala4Val、Ala122Val、Lys194Arg和Ala468Asp,定点突变结果表明Ala122Val和Ala468Asp位点为影响其比酶活和最适反应温度的关键。进一步将突变体mTd-amy在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵其酶活达64696 U/mL。结论:定向进化获得了嗜热杜邦菌来源α-淀粉酶的正向突变体,该突变体的最适温度和比酶活力均明显提高,为α-淀粉酶的分子改造以及工业化应用等提供了理论参考。