用于高果糖浆制备的宛氏拟青霉嗜热嗜酸菊粉酶酶学特性分析

为实现酶法水解菊糖制备高果糖浆,从宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）XS27发酵液中分离纯化菊粉酶,并对其酶学特性进行研究。发酵液经过硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow层析、Sephacry S-100分子筛过滤层析,得到电泳纯的菊粉酶,比活力327.4 U/mg,纯化倍数37.85。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳测得菊粉酶为单一亚基的酶蛋白,分子质量62.0 kDa。菊粉酶能在较宽的pH值范围（3.5～6.5）内保持高活性,最适作用pH 4.0。在温度40～65 ℃之间,酶活力较高,最适作用温度为60 ℃。薄层色谱分析显示菊粉酶水解菊糖最终产物为果糖。以菊糖为底物,酶的Km和Vmax分别为5.93 μmol/L和75.18 μmol/（L·min）。Mg2＋、Mn2＋、Ca2＋对酶有显著激活作用,Ba2＋、Ni2＋和Hg2＋对酶有一定抑制作用。β-巯基乙醇、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸对酶有抑制作用,表面活性剂（十二烷基硫酸钠、Tween 80和Trition X100）以及乙醇对酶活力没有影响。从宛氏拟青霉XS27发酵液中分离纯化的菊粉酶在强酸高热的环境下具有强活性和稳定性,对表面活性剂乙醇有高耐受性,适合于果葡糖浆的工业化生产。     

坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶的纯化以及酶学性质

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-50凝胶过滤、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）xy-7发酵液进行分离纯化,获得纯化的木聚糖酶,纯化倍数为26.36,酶活回收率为5.13%。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果为单一条带,分子质量为24.5 ku。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为8.0。K+、Fe2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+对酶有强烈的抑制作用。以榉木木聚糖为底物时,米氏常数Km=4.733 mg/mL,最大酶反应速率Vm=315.85 μmol/（min·mg）。     

纳豆纤溶酶--纳豆激酶的分离提纯及稳定性研究

实验采用硫酸铵分步盐析，Sepharose Butyl Fast Flow疏水层析，Sephamse CM Fast Flow离子交换层析和Superdex75凝胶层析，对纳豆浸提液进行分离纯化，得到电泳纯的纳豆激酶。并研究了纳豆激酶的稳定性，实验结果表明，温度对酶活影响显著；pH6—8范围内酶活相对稳定；Zn^2＋、亚硫酸钠对酶活有较大的抑制作用；Al^3＋、Cu^2＋苯甲酸钠对酶也有一定程度的抑制；Mg^2＋、Ca^2＋、甘油、明胶、蔗糖、香精是较好的酶活稳定剂和促进剂。     

产黄青霉抗真菌几丁质酶的纯化及特性分析

为实现抗真菌性能的耐热新型几丁质酶在食品防腐及生物防治方面的应用，从产黄青霉Xch23中分离纯化几丁质酶（Chi-Pc76）并研究其应用特性。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose A52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化得到均一的Chi-Pc76。最终得到Chi-Pc76纯化倍数17.1 倍，回收率21.6%，比活力为584.8 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得Chi-Pc76分子质量61 kDa。纯化后的Chi-Pc76最佳反应条件为pH 6.0、温度55 ℃。Chi-Pc76在宽泛的pH 4.0～10.0之间稳定性强，其显著的热稳定性可达到70 ℃。Chi-Pc76对底物胶体几丁质具有高的底物特异性，对乙二醇几丁质、α-几丁质、β-几丁质有中等活性，而对其他受试底物无活性或痕量活性。以胶体几丁质为底物Km和Vmax值分别为0.25 mg/mL和20 μmol/（min·mg）。金属离子Ca2＋、Ba2＋、K＋、Na＋对酶有明显激活作用；十二烷基硫酸钠、吐温80、苯甲基磺酰氟和尿素对酶活力基本无影响，但Mn2＋、Co2＋、Fe2＋、Ag＋、Cu2＋、Zn2＋、Pb2＋、Hg2＋和β-巯基乙醇、二硫苏糖醇均对酶活力有抑制作用。Chi-Pc76对黑曲霉、黄曲霉、尖孢镰刀菌和橘青霉均有显著的抗真菌活性，对比文献为产黄青霉抗真菌几丁质酶。鉴于Chi-Pc76纯化简便、热稳定性好、宽广的pH值稳定性、高效降解几丁质和抗真菌等特点，产黄青霉Xch23几丁质酶在几丁质废料综合利用、生物转化药理活性产品、食品保鲜以及植物病原性真菌和昆虫幼虫生物防治等方面具有潜在价值。     

文蛤纤维素酶分离纯化及性质

采用缓冲液提取、(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析,从文蛤(Meretrix meretrix L)中分离纯化出一种纤维素酶。结果显示:纯化后的纤维素酶比活力达到40.33 U/mg,纯化倍数为13.12;SDS-PAGE检测其亚基相对分子质量为59 700;文蛤纤维素酶的最适pH为5.2,最适反应温度为45℃,该酶在p H 4～6和4～50℃范围内有较好的稳定;在最适条件下,以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物测得其Km值为0.111 mmol/L。     

深绿木霉嗜酸性阿魏酸酯酶酶学性质及生物质转化分析

为实现生物质的高效降解,制备具有重要生理功能的阿魏酸,本实验从深绿木霉XS6发酵液中分离纯化深绿木霉阿魏酸酯酶（Trichoderma atroatroviride feruloyl esterase,TaFAE）,并研究酶学特性。发酵液经(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Cellulose DE52阴离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析后,得到电泳纯的TaFAE,比活力134.3 U/mg,回收率28.9%,纯化倍数31.52。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳测得酶分子质量约为66.4 kDa。TaFAE对阿魏酸甲酯亲和力最高,以其为底物,酶Km值和Vmax值分别为0.53 mmol/L和16.74 μmol/（min·mg）。以芥子酸甲酯为底物,酶促反应速率最大,达到32.21 μmol/（min·mg）,是阿魏酸甲酯的2 倍,对咖啡酸甲酯无活性,说明该酶具有严格的底物特异性。TaFAE最适pH值和温度分别为pH 4.0和40 ℃。在pH 2.0～9.0的范围内,30～40 ℃温度下都表现出良好的稳定性。金属离子Ca2＋和Mg2＋对TaFAE活性有显著激活作用,重金属离子Hg2＋和Pb2＋几乎完全抑制酶活性;β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、十二烷基硫酸钠、Trition X-100增强酶活性,苯甲基磺酰氟有较强的抑制作用。木聚糖酶降解生物质的体系中加入TaFAE可显著增加阿魏酸和还原糖产量,表明TaFAE和木聚糖酶有良好协同作用。综上所述,TaFAE优良的耐酸性及其他酶学性质说明其在食品和饲料行业有较好的应用潜力。     

绿色木霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

针对绿色木霉AS3.3711产生的β-葡萄糖苷酶组分,先后运用包括乙酸铵沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝胶柱层析在内的一系列分离纯化技术对该纤维素酶进行纯化,得到β-葡萄糖苷酶纯化组分,并对该酶的酶学性质进行研究。纯化后酶液的蛋白质量浓度为8.12 mg/mL、酶活力为4.08 U/mL,纯化倍数达到18.48,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）测定分子质量为66.0 kD。绿色木霉β-葡萄糖苷酶在酸性条件下稳定性良好,最适pH值为5.0;在温度60～70 ℃能长时间保持较高酶活力,最适反应温度为60 ℃。金属离子中,Ca2+、Mg2+、K+对绿色木霉AS3.3711 β-葡萄糖苷酶活力起到促进作用,Ca2+促进作用最强;而Zn2+、Fe3+对该酶有抑制作用,Ag+、Cu2+、Hg2+重金属离子使β-葡萄糖苷酶几乎丧失了全部活性。     

杂色鲍组织蛋白酶L的分离纯化与性质研究

通过硫酸铵分级沉淀、SP-Sepharose阳离子交换层析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤和Hydroxyapatite羟基磷灰石层析,从杂色鲍（Haliotis diversicolor）内脏中分离纯化了组织蛋白酶L。SDS-PAGE结果显示,纯化蛋白的分子量约为28ku。该酶最适温度37℃,最适pH5.5。当温度低于40℃,pH在5.0～6.5范围内该酶较稳定。底物特异性实验与抑制剂实验结果表明,该酶属于半胱氨酸蛋白酶。金属离子Mn2＋、Ba2＋和Mg2＋对该酶有不同程度的激活作用,而Co2＋、Cu2＋、Zn2＋、Fe2＋和Ca2＋等对该酶起抑制作用。     

生淀粉糖化酶的菌种筛选及酶学研究

从自然界分离到一株高酶活性的生淀粉糖化酶菌株黑曲霉Sx。在最适产酶条件;固体培养基pH6.5,固水比1：1.6,30℃发酵24h酶活达382u/g。经纸层析鉴定酶解产物为葡萄糖。粗酶液在贮藏时,当酶液中的SDS浓度达6mg/ml时,30℃保藏10天,酶活保持不变。分析经初步分离提纯的酶的性质得：以玉米淀粉为底物时,该酶最适pH4.5,最适酶反应温度为60℃。pH4.0-7.0范围内酶活力稳定,酶具有较强的热稳定性,80℃保温1h以后,酶活力仍能保持15％。金属离子等对酶的影响为：Ag^＋、Sn^2＋对酶有强烈抑制作用;Hg^2＋、Zn^2＋、Mn^2＋、Cu^2＋有抑制作用：EDTA、Ca^2＋、Fe^2＋对酶无影响;Co^2 、K^ 有一定的激活作用。     

牙鲆肌肉赖氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究

通过DEAE-Sephacel阴离子葡聚糖纤维素交换层析,Phenyl Sepharose6-Fast Flow苯基葡聚糖凝胶疏水层析和DEAE Sepharose-Fast Flow阴离子葡聚糖凝胶交换层析,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)肌肉中分离纯化得到1种赖氨酸氨肽酶,并对其生化性质进行研究。牙鲆赖氨酸氨肽酶的分子质量约为100 ku。该酶的最适温度45℃,最适pH 7.5,二价金属离子对酶活性有较大影响,EDTA和EGTA等金属螯合剂对其活性有抑制作用。该酶对荧光合成底物Lys-MCA分解作用最强,而对内肽酶对应的荧光底物没有分解作用。免疫印迹反应结果显示,该酶与鲤鱼肌肉中亮氨酸氨肽酶同源性较高,并在牙鲆多种器官中均有分布。     

一株嗜热菌木糖异构酶的纯化与性质研究

研究了1株嗜热菌(Anoxybacillus flavithermus)所产木糖异构酶的分离纯化以及酶学性质。结果表明,经硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤、纤维素DE-52弱阴离子交换柱和Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析得到的木糖异构酶,分子量约为181 ku,由4个相同分子量的亚基组成。酶反应的最适温度为80℃,最适为pH为7.0且最适pH范围宽泛,pH6.0~11.0酶反应活性能保持80%左右。该酶热稳定性及耐碱性能良好,70℃保温1 h后酶活仍能保持近80%左右;pH5.0~8.0保温1 h后酶活仍能保持近80%以上,甚至pH12.0保温1 h后酶活性仍能保持40%左右。Mn2+和Co2+对酶活性有明显促进作用,Zn2+、Cu2+以及Al3+对酶活性有一定程度的抑制。     

猪肉中AMP脱氨酶的分离纯化及其特性研究

从生鲜猪肉中分离提纯AMP脱氨酶（AMPD）,并对其性质进行了研究。将猪肉AMP脱氨酶的初提物经磷酸纤维素层析、Q-Sepharose Fast Flow层析及5’-AMP琼脂糖层析等纯化步骤,得到经聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白质区带的酶液。提纯倍数为133.68,酶液比活力2.5U/mg。利用凝胶过滤法测定酶的相对分子量为178ku,SDS-PAGE测定酶的亚基相对分子量为87ku。酶的等电点为6.81。酶催化AMP脱氨反应的最适pH为5.9,pH在5.2⁶.4的范围内稳定。最适温度为37℃,高于42℃时不稳定。不同来源的AMP脱氨酶其激活剂及抑制剂基本一致。      

构巢曲霉产植酸酶的酶学特性分析

从构巢曲霉AnP-16菌株发酵液中纯化单一组分的耐热耐酸植酸酶,并对酶学特性进行分析,为其在食品工业中的应用提供理论依据。通过硫酸铵盐析、离子交换层析和疏水层析纯化植酸酶,SDS-PAGE电泳测定其分子量。结果表明,从该菌株发酵液中纯化到了单一组分的植酸酶,纯化倍数60.8倍、回收率41.6%,酶分子量约52 kDa。植酸酶最适作用温度和pH分别为55 ℃和pH4.0,在pH3.0~6.0范围酶活性较高,pH2.0~7.0下孵育3 h,仍能保持80%以上活性。植酸酶耐热性好,70 ℃孵育1 h仍能保持81%活性。Hg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺ 5 mmol/L浓度下对酶活性有明显抑制作用,但Ca²⁺和Mg²⁺在1和5 mmol/L浓度时均增强酶活性;有机溶剂甲醇和乙醇在2%浓度有激活作用;SDS抑制酶活性,但其它表面活性剂(Triton X-100和Tween 80)和有机溶剂(丙酮和异戊醇)对酶活性无明显影响。植酸酶有宽泛的底物特异性,但对植酸钠的催化活性最强,其K_m值为0.576 mmol/L。基于植酸酶耐酸耐热及宽广的底物催化活性,其有望应用于粮油食品加工领域,提高食品的营养价值。     

一株褐藻酸裂解酶高产菌的筛选及其酶学性质研究

从腐烂的海带中筛选出一株褐藻酸裂解酶（Aly）高产菌,经形态学分析、生理生化特征和分子水平鉴定,该菌为交替假单胞菌属,命名为Pseudoalteromonas sp. EE258。利用硫酸铵沉淀、快流速DEAE-琼脂糖凝胶（DEAE-sepharose Fast Flow）和丙烯葡聚糖凝胶（Sephacryl S-100）柱层析等方法,对Pseudoalteromonas sp. EE258产生的褐藻酸裂解酶Aly-EE258进行分离纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定该酶的分子质量为23 ku。酶学性质研究显示：该酶的最适反应温度为40 ℃,最适反应pH值为7.0,在20 ℃以下时稳定性较好,Ca2+和Ba2+能明显提高酶的活性,Fe2+、Al3+、Mg2+和乙二胺四乙酸（EDTA）抑制酶的活性。Aly-EE258能不同程度地裂解褐藻酸、聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸,其中聚甘露糖醛酸裂解后主要产生单一的低聚寡糖,在实际应用方面具有重要意义。     

黑曲霉SL2-111产果胶酯酶的纯化与性质

通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、Sephacryl S-200分子筛柱层析3个步骤,从黑曲霉SL2-111发酵的果胶酶粗品中纯化出一种电泳纯的果胶酯酶。经SDS-PAGE测定其分子质量约为48.8ku。最适pH值和最适温度分别为5.8和60℃。在50℃以下,pH值5.8-6.2之间酶活力相对稳定。     

Transglutaminase from Streptoverticillium ladakanum and application to minced fish product

The transglutaminase (TGase) from Streptoverticillium ladakanum was purified to electrophoretic homogeneity after ammonium sulfate fractionation and Blue Sepharose Fast Flow chromatography. The molecular weight of the purified TGase was 30.5 kDa estimated by Superdex 75HR gel filtration, and 37.5 kDa by SDS-PAGE. This enzyme, with optima at pH at 6.0 and 50°C was very stable at pH 5.0–7.0. It was strongly inhibited by PCMB, PMSF, Pb²⁺, Zn²⁺ and Cu²⁺, but not affected by EDTA and Ca²⁺. This suggested that the purified TGase was calcium-independent and its active center contained cysteine. It catalyzed the crosslinking of fish myosin heavy chain and substantially increased the gel strength of mackerel surimi.     

海参自溶酶的分离纯化和部分性质研究

采用硫酸铵分级盐析 ,Sephadex 1 0 0分子筛柱层析从新鲜海参肠中分离纯化海参自溶酶。研究发现 ,所纯化的酶为酸性蛋白酶 ,分子质量约为 68 5ku ;最适作用温度为 3 5℃ ,对热不稳定 ;酶的最适作用pH为 7 0 ;金属离子Pb2 + 、Hg2 + 、Cd2 + 、Mn2 + 对酶的活性有抑制作用 ;Zn2 + 、Mg2 + 、Cu2 +则对酶有不同程度的激活作用