高纳豆激酶酶活枯草芽孢杆菌的筛选及菌种鉴定

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,对能产生纳豆激酶的菌株进行了分离筛选,得到了具有较高纤溶活性的四株,考虑到发酵后的纳豆感官,我们最终选择编号为4411、465的菌株作为生产用菌种.根据其形态、生理生化特征以及与枯草芽孢杆菌的比较,初步判断这两株菌株为枯草茅孢杆菌（Bacillus subtilis）.     

响应面法优化枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶发酵条件

以分离于纳豆中的枯草芽孢杆菌MX-6为研究对象,通过单因素试验确定温度、初始pH值、接种量、装液量及摇床转数对纳豆激酶活力的影响,应用响应面法的Box-Behnken设计对纳豆激酶发酵条件进行优化。当温度36.69℃、初始pH 6.94、接种量3.03%、装液量48.77 mL、摇床转速170.05 r/min时可获得最大的纳豆激酶溶圈直径20.71 mm,与优化前的溶圈直径相比提高35.54%,表明该模型能科学地预测纳豆激酶的合成情况。结果显示响应面法可有效、成功地优化纳豆激酶发酵条件。     

枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质

利用30%～70%饱和度的硫酸铵沉淀,Sephadex G-50凝胶过滤层析对浅盘发酵纳豆激酶进行分离纯化并对其酶学性质进行初步研究。以纤维平板法测定纳豆激酶活力,SDS-PAGE检验纯化效果。结果表明:纯化后纳豆激酶为电泳纯,分子质量约27.518kD,纯化倍数和酶活回收率分别为19和42.1%,纳豆激酶最适温度为50℃,最适宜pH值为8.0。     

高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌优选及发酵工艺条件优化

以黄豆为主料,添加不同辅料,采用不同处理方式,以产酶活力为指标研究三株枯草芽孢杆菌发酵性能,筛选优势菌株进行固态发酵,确定最优工艺条件。结果表明:在三株受试菌种中BS21076发酵性能最优,活菌数及纳豆激酶活力均较高;最优固态发酵条件为:大豆90℃下烘炒5min,破碎度为四瓣,魔芋精粉添加量3%,接种量为8%,37℃下发酵24h;在此条件下,酶活力可达(3582.48±83.13)U/g,较传统发酵NK活力极显著(p0.01)提高。     

高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌优选及发酵工艺条件优化

以黄豆为主料,添加不同辅料,采用不同处理方式,以产酶活力为指标研究三株枯草芽孢杆菌发酵性能,筛选优势菌株进行固态发酵,确定最优工艺条件。结果表明:在三株受试菌种中BS21076发酵性能最优,活菌数及纳豆激酶活力均较高;最优固态发酵条件为:大豆90℃下烘炒5min,破碎度为四瓣,魔芋精粉添加量3%,接种量为8%,37℃下发酵24h;在此条件下,酶活力可达(3582.48±83.13)U/g,较传统发酵NK活力极显著(p<0.01)提高。      

以豆粕粉为氮源的枯草芽孢杆菌液态发酵生产纳豆激酶

枯草芽孢杆菌液态发酵通常采用蛋白胨作为氮源生产纳豆激酶,导致生产成本过高,发酵液中酶活性较低。采用价格低廉的豆粕粉作为氮源不仅大幅度降低了原料成本,而且显著提高了发酵液中的酶活性。在摇瓶实验中优化确定豆粕粉最佳添加量,并在此基础上优化确定了最佳接种量、发酵液初始p H、发酵时间。最终摇瓶发酵液中酶活达到5 471 IU/m L,是等量胰蛋白胨作为氮源发酵的3.6倍。上述摇瓶发酵参数进一步在7 L发酵罐和200 L中试水平发酵罐进行验证,并优化确定发酵过程中控制溶氧水平为30%,纳豆激酶活性分别达到6 717 IU/m L和4 236 IU/m L。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

以纳豆芽孢杆菌HL-1全基因组DNA为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽及成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-NK),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因序列(pro-NK)和只编码成熟肽的纳豆激酶基因序列(NK),构建了大肠杆菌表达质粒pET28a-NK表达前纳豆激酶原基因及大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHT315-NK表达纳豆激酶原基因和纳豆激酶基因,实现了纳豆激酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达,并进行了活性分析。     

溶栓纳豆芽孢杆菌的筛选鉴定及产纳豆激酶条件的研究

利用目标纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)所应具有的耐热性、耐盐性、显著的蛋白酶活性及生物素缺陷等生物学特性,设计了定向选育方案,从日本传统食品纳豆中筛选出具有较高纤溶活性的8株枯草芽孢杆菌,命名为 NK-1～NK-8；根据菌落形态、生理生化特征,鉴定为纳豆芽孢杆菌。NK-4菌株经过发酵培养,液体培养指数生长期为4～12h,最佳产酶条件是 pH7．0,培养温度34℃,装液量100mL/500mL。     

通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

本研究通过串联启动子方式实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800中的高效分泌表达。通过对几种现有报道的强启动子的比较并对其进行串联操作,确定生产纳豆激酶的最优启动子及纳豆激酶的最高产量。本研究首先在枯草芽孢杆菌WB800中成功构建五种含不同强启动子的重组质粒p SG101(P_(HpaII)),p SG102(PBcapr E),p SG103(Plux S),p SG104(Pgsi B)和p SG105(Pyxi E),实现纳豆激酶分泌表达,并对其纤溶活性进行测定。结果表明,启动子P_(HpaII)介导的纳豆激酶纤溶活性(110.80 FU/m L)明显优于其他四种启动子。通过对启动子P_(HpaII)进行多次串联,成功构建质粒p SG106(P_(HpaII)-P_(HpaII)),p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))和p SG108(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))。数据显示,菌株Bacillus subtilis WB800/p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))纳豆激酶产量最高为213.30 FU/m L,相比单个启动子P_(HpaII),提高了92.51%。通过对五种强启动子的比较以及对其进行串联操作,成功实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800的高效表达,纤溶活性最高为213.30 FU/m L,与现有相关报道相比有明显优势。     

一株产纳豆激酶菌株的分离筛选及鉴定

对能产生纳豆激酶的菌群进行了筛选,分离得到了1株具有较高纤溶活性的菌株N391,其纳豆激酶相当于1722.4U/mL尿激酶的酶活。利用细菌16S rDNA通用引物对其16S rRNA进行PCR扩增,得到1511bp的片段,该PCR产物序列通过Blast软件在NCBI网站中进行同源性比较,通过DNA MAN和MAGE3.1软件绘制系统发育树,结果表明,菌株N391的16S rRNA序列(DQ906100)与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的16S rRNA序列的同源性在99%以上,在系统发育树中,菌株N391与Bacillus subtilis在同一分支,且遗传距离最短。结合常规的形态、生理生化鉴定,N391的形态及大部分生理生化特征与Bacillus subtilis极为相似,表明菌株N391属于Bacillus subtilis的1个菌株,由此初步确定该菌在微生物系统发育学上的地位。     

花生粕固态发酵产纳豆激酶的工艺优化

探索纳豆菌固态发酵花生粕制备纳豆激酶的最佳工艺条件。以纳豆激酶活力为主要评价指标,在单因素实验基础上,通过正交实验优化花生粕固态发酵制备纳豆激酶的工艺条件。得出最佳发酵条件:发酵温度37℃,发酵时间24 h,接种量10%,料液比1∶0.4 g/m L。在此条件下测得发酵产物的纳豆激酶活力达到3162 U/m L,比单因素最高酶活提高了18%(2680 U/m L),可溶性氮含量为5.6 mg/m L,羟自由基清除率为74%,铁还原力的OD值为0.906。      

枯草芽孢杆菌SX3411产羊毛硫细菌素subtilomycin的初步鉴定与理化特性分析

为了确定分离得到的枯草芽孢杆菌SX3411(Bacillus subtilis SX3411)具有产羊毛硫细菌素subtilomycin的能力和subtilomycin的理化特性。利用滤纸片扩散法检测到菌株SX3411发酵液对猪链球菌(Streptococcus suis)、枯草芽孢杆菌(非本筛选菌株)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和嗜水性单胞杆菌(Aeromonas hydrophila)具有抑菌作用。通过基因簇克隆和测序,表明其中抑菌物质主要为羊毛硫细菌素subtilomycin。理化特性分析表明菌株SX3411发酵液中抑菌物质具耐热和耐酸碱特性。SDS-PAGE检测表明subtilomycin分子质量在4 k Da左右。模拟胃液对subtilomycin抑菌活性影响不大,但不耐蛋白酶K和模拟肠液的处理。该研究为进一步开发应用羊毛硫细菌素subtilomycin奠定了基础。     

纳豆菌生产微量生理活性物质的研究

高桥和宫城纳豆菌接种于大豆豆渣或大豆煮汁粉培地都能增殖。固体培养时,只有宫城菌在20%豆渣培地能生产出2,6-吡啶二羧酸。液体培养时,0.5%大豆煮汁粉培地比2%大豆煮汁粉培地生产了多量的2,6-吡啶二羧酸;同样的液体培养条件,高桥菌比宫城菌能生产出更多的维生素K2(MK-7)。     

纳豆菌分批发酵纳豆激酶动力学研究

通过三联30L全自动发酵罐对纳豆菌的分批发酵动力学进行了研究,结果表明,纳豆菌的生长与限制性基质葡萄糖浓度之间符合Logistic方程,建立了细胞生长、产物合成和基质消耗随时间变化的数学模型。应用MATLAB软件对发酵动力学模型进行最优参数估计和非线性拟和,获得最大比生长速率(μm)和产物得率(YP/X)分别为0.228h-1、5.835g/g,模型模拟计算结果与和实验值能较好地吻合,动力学研究结果表明该模型能较好地反映细胞的生长、底物消耗和产物合成过程机制。     

枯草芽孢杆菌PNG27生产凝乳酶的发酵工艺优化及分离纯化研究

通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计、Box-Behnken响应面试验设计对培养基成分及发酵条件进行了优化,使最终发酵液凝乳酶活力达到222.34±4.99 U/m L。采用乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛等分离手段对枯草芽孢杆菌PNG27凝乳酶进行分离纯化,得到电泳纯的凝乳酶。结果表明,酶的比活力达到794.30 U/mg,纯化倍数为8.29倍,最终回收率为4.25%,SDS-PAGE电泳分析凝乳酶分子质量约为42 k Da。     

纳豆激酶液体发酵条件研究

研究了纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）液体发酵生产纳豆激酶的最佳发酵条件。摇瓶实验发现：3％的大豆蛋白胨为氮源，2％的葡萄糖为碳源，添加Na2HPO4 0.6％、NaH2PO4 0.1％、CaCl2 0.02％和MgSO4 0.05％，调节pH为7．0-7．2，接入体积比为2％的菌种悬液，在200r／min、37℃发酵60h，发酵液中NK的酶活力可达736IU／mL相当的尿激酶活力。     

纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶发酵工艺控制及纤溶酶分析

基于摇瓶发酵优化结果,在10 L发酵罐中研究了纳豆芽孢杆菌TN-02产纳豆激酶的发酵控制工艺,分析了发酵产物中纤溶酶的组分纯度。在放大发酵过程中,考察了培养温度和主要碳、氮源的流加补充对产酶的影响,并利用卡那霉素抗性基因kan对纳豆芽孢杆菌TN-02中的纳豆激酶基因aprN进行了部分替换和插入失活,获得了aprN突变的重组菌TN-021。结果表明,通过温度的阶段性控制和甘油、胰蛋白胨补料发酵,获得纳豆激酶的最高表达量为13 978.3 U/mL,是摇瓶发酵最高表达量的1.8倍;在菌株TN-021的摇瓶发酵产物中未检测到纤溶酶活力,证明了纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌TN-02发酵产物中唯一纤溶酶。研究结果为纳豆激酶高水平发酵放大工艺控制奠定了基础,同时为纳豆激酶的品质分析方法提供参考。     

Volatile compounds profile and sensory evaluation of Beninese condiments produced by inocula of Bacillus subtilis

BACKGROUND: Three Beninese food condiments (ABS1_24h, IBS2_48h and SBS3_48h) were produced by controlled fermentation of African locust beans using inocula of pure cultures of Bacillus subtilis, BS1, BS2 and BS3, respectively. Quantitative and qualitative assessments of the volatile compounds in the condiments produced have been performed using the Likens–Nickerson simultaneous distillation–extraction method and GC–MS analysis, followed by a sensory evaluation in comparison with the spontaneously fermented condiments. RESULTS: A total of 94 volatile compounds have been found including 53 compounds identified in relatively high concentrations and were subdivided into seven main groups with the predominance of four major groups: pyrazines, aldehydes, ketones and alcohols. Compared to the spontaneously fermented condiments, volatile compounds identified in controlled fermented condiments have been found in high number and in concentrations which varied according to the inoculum of B. subtilis used. The condiments produced with starter cultures scored significantly (P < 0.05) higher for odour than the spontaneously fermented condiments. But the overall acceptability (7/10) of the two types of condiments was similar. CONCLUSION: The investigated B. subtilis, BS1, BS2 and BS3 can be considered as potential starter cultures for the fermentation of African locust beans to produce good quality of Beninese food condiments. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry