大肠杆菌PTSNtr相关基因缺失对苏氨酸合成的影响

大肠杆菌的氮磷酸转移酶系统（nitrogen phosphotransferase system,PTSNtr）在其工作过程中会消耗L-苏氨酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸,敲除相关基因或可影响苏氨酸合成。作者利用CRISPR-Cas9系统,分别敲除PTSNtr相关基因ptsP、ptsO和ptsN,构建得到突变株MZ001、MZ002和MZ003。通过对出发菌株和突变菌株测定生长曲线,发现ptsP、ptsO和ptsN的单缺失使菌株培养前期生长迟缓,迟滞期延长,后期快速生长,稳定期生物量积累大于出发菌株。之后在出发菌株和突变菌株中引入含有苏氨酸合成的3个关键酶编码基因thrA*、thrB和thrC以及苏氨酸转运蛋白编码基因rhtC的表达质粒。对比菌株MG1655/pFW01-thrA*BC-rhtC,菌株MZ001/pFW01-thrA*BC-rhtC、MZ002/pFW01-thrA*BC-rhtC和MZ003/pFW01-thrA*BC-rhtC苏氨酸的产量有明显提高,分别为3.805、1.722、3.091 g/L。本研究表明,大肠杆菌的PTSNtr相关基因的敲除对提高其L-苏氨酸的合成能力有促进作用。     

代谢副产物对L-苏氨酸发酵的影响及应对措施

研究了L-苏氨酸的发酵过程,通过高效液相色谱和氨基酸分析仪测定了L-苏氨酸发酵液中的主要副产物为乙酸、乳酸、缬氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等。利用外源添加实验研究了各种代谢副产物对L-苏氨酸发酵的影响。结果表明乙酸浓度高于2 g/L、乳酸浓度高于10 g/L时对L-苏氨酸生产菌的生长和产酸有抑制作用,采用提高溶解氧和葡萄糖限制性脉冲流加措施将乙酸、乳酸的浓度控制在0.5 g/L以下,L-苏氨酸产量明显提高。     

L-苏氨酸发酵过程中乙酸的控制

大肠杆菌是表达外源基因常用的宿主菌,然而在培养过程中容易发生副产物乙酸的积累,不仅造成碳源的浪费,而且严重抑制菌体生长及外源基因的表达.本研究利用一株自主构建的大肠杆菌基因工程菌(MHZ0200-2)发酵生产L-苏氨酸.通过选择合适的发酵条件来控制其副产物乙酸的生成,从而提高L-苏氨酸的产量.L-苏氨酸的初始产量是0.09g/L,培养条件优化后产量提高到2.06g/L.     

大肠杆菌转运蛋白SstT和RhtC的改造对L-苏氨酸产量的影响

L-苏氨酸是一种必需氨基酸,广泛应用于食品、医药和饲料等领域。有报道表明降低胞内L-苏氨酸浓度,解除其对合成途径酶的反馈作用,有利于提高L-苏氨酸产量,因此,本实验利用Red重组技术和基因过表达技术,以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli TRFC为出发菌株,成功构建了TRFCΔsstT和TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC。摇瓶发酵结果显示,与原菌相比,TRFCΔsstT的L-苏氨酸产量较原菌提高了4.00%,TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC的L-苏氨酸产量较TRFCΔsstT+pSTV28提高了18.16%。此外,经检测发现重组菌株胞内L-苏氨酸浓度均低于原菌。最后进行了TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC的5 L分批补料发酵实验,其L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别较原菌提高了15.33%和16.14%。综上所述,通过改造L-苏氨酸转运系统的SstT和RhtC蛋白,能有效地增强细胞内L-苏氨酸外排能力,降低细胞内L-苏氨酸的浓度,进而有利于L-苏氨酸产量的提高。     

碳源对L-苏氨酸发酵的影响

以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株,研究了碳源对L-苏氨酸发酵的产量和糖酸转化率的影响。采用补料分批发酵工艺生产L-苏氨酸,利用氨基酸分析仪测定发酵液中L-苏氨酸的产量。确定了发酵的最佳碳源及其补料方式,通过10L罐补料分批发酵36h,产酸可达118.9 g/L,糖酸转化率为47.6%。     

转录和蛋白质组学分析热空气处理对桃果实采后冷藏期间糖酸和酚类物质代谢的影响

桃果实采后低温贮藏易发生冷害,为研究热空气（hot air,HA）处理对桃果实冷藏过程中调控代谢途径的作用,本实验采用HA处理（40 ℃、4 h）桃果实,于（1±1）℃下贮藏35 d,每隔7 d取样并对可溶性糖、柠檬酸、苹果酸、总酚、总黄酮含量和花色苷含量等指标进行测定,同时选取样品进行转录组学和蛋白质组学分析。结果表明：HA处理可以有效抑制桃果实冷藏期间蔗糖、柠檬酸、苹果酸、总酚和总黄酮含量的下降,并抑制果糖和葡萄糖含量的上升,同时HA显著提高了桃果实花色苷的含量（P＜0.05）。转录组和蛋白质组学分析结果表明,HA处理调控的差异表达基因和蛋白主要集中于碳水化合物代谢和次级代谢物代谢途径;桃果实糖酸代谢变化主要与转化酶、蔗糖合酶、蔗糖磷酸合酶、苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶基因和蛋白的表达有关;HA通过上调苯丙氨酸解氨酶、香豆酸CoA连接酶、查耳酮合酶、二氢黄酮醇还原酶、花青素合成酶和类黄酮葡萄糖基转移酶的表达量,促进酚类、黄酮类和花青素的合成。综上所述,HA处理可以有效延缓桃果实采后糖酸和酚类物质含量的下降,并提高果实花色苷的含量。     

微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展

L-苏氨酸作为一种必需氨基酸被广泛用于食品、饲料、医药及化妆品行业。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵法生产。代谢工程技术的应用为菌种选育开辟了有效途径,使在现有高产基础上进一步提高氨基酸的产量成为可能。作者对两大氨基酸生产菌——大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中的L-苏氨酸生物合成相关途径、代谢调控机理以及运用代谢工程技术提高L-苏氨酸产量所取得的成果进行了系统综述。     

谷氨酸合成途径基因缺失对大肠杆菌发酵L-色氨酸的影响

降低谷氨酸的积累可提高L-色氨酸产量及糖酸转化率。敲除Escherichia coli TRTH中的谷氨酸脱氢酶及谷氨酸合成酶编码基因gdh A、glt B,构建TRTHA(TRTH,Δgdh A)、TRTHB(TRTH,Δglt B),考察gdh A、glt B缺失对L-色氨酸发酵的影响。结果表明,gdh A及glt B缺失能有效降低谷氨酸的积累,但会降低细胞生长及色氨酸合成;培养基中谷氨酸的添加可恢复TRTHA及TRTHB的生长及色氨酸合成能力。在含1 g/L谷氨酸培养基中,利用TRTHB发酵L-色氨酸,L-色氨酸产量(41.23 g/L)及糖酸转化率(15.45%)最高,较TRTH分别提高了10.92%和7.89%;谷氨酸生成量(5.72 g/L)及乙酸积累量(1.73 g/L)分别较TRTH降低了25.23%及提高了10.19%。TRTH和TRTHB代谢流分析结果表明,glt B缺失会降低谷氨酸合成代谢流并提高乙酸合成代谢流;TRTHB的色氨酸合成代谢流(11.4%)较TRTH提高了40.74%。     

谷氨酸棒杆菌苏氨酸脱氨酶基因敲除及对L-亮氨酸发酵的影响

L-异亮氨酸是L-亮氨酸发酵的主要副产物,L-异亮氨酸的积累对L-亮氨酸的发酵及提取均产生不利影响。采用基因重组技术敲除L-亮氨酸产生菌-谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TGL8207的苏氨酸脱氨酶基因ilvA,构建了ilvA缺失株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)TGL8207 ilvA。发酵结果显示:ilvA基因缺失对TGL8207 ilvA的生长影响很小。与供试菌比较,TGL8207 ilvA的L-亮氨酸产量和糖酸转化率分别提高了8.4%和1.9%。     

高产L-苏氨酸的缺陷型大肠杆菌发酵条件优化研究

采用选育高产大肠杆菌,对原发酵培养基配方中葡萄糖、玉米浆和硫酸铵配比含量及摇瓶工艺的摇床转速、温度、培养基装液量和菌液接种量优化,测定不同条件下的L-苏氨酸含量。结果表明,以5%的接种量,37 ℃,220 r/min条件下,发酵培养基中葡萄糖含量为41.0 g/L、玉米浆含量为11.0 g/L和硫酸铵含量为20.0 g/L时,赖氨酸缺陷型菌株的L-苏氨酸产量为5.90 g/L,与优化前(4.06 g/L)相比产率提高了45.32%,甲硫氨酸缺陷型菌株的L-苏氨酸产量为5.76 g/L,比优化前相比(3.89 g/L)产率提高了48.07%。     

油茶脂肪酸代谢途径中关键酶基因调控油脂合成的规律研究

以国审油茶"华硕"和普通油茶"望城1号"不同发育时期种仁为材料,分析种仁含油率、脂肪酸成分和脂肪酸代谢关键酶基因表达规律。结果表明,油茶酰基载体蛋白基因(CoACP)、硬脂酰脱饱和酶基因(CoSAD)和油酸脱氢酶基因(CoFAD2)表达规律与油茶种仁成熟程度有关而与品种关系不大;"华硕"较"望城1号"生殖发育期长,成熟期晚,脂肪酸各成分变化幅度大,采收期可比"望城1号"延迟1个月;10月底采收时虽然"华硕"含油率低于"望城1号",但不饱和脂肪酸含量却高些,若延迟采收"华硕"可保产量质量均优。     

通过体外代谢途径构建确定乳酸合成关键酶

基于代谢控制分析理论提出了一种通过体外代谢途径构建和分析确定关键酶的方法并应用其确定乳酸高产菌株中的关键酶。首先获得高产菌株的粗酶液并测定葡萄糖到乳酸合成途径中各种蛋白的绝对浓度,进而通过向粗酶液中分别添加同等比例的各纯酶对途径进行扰动,并由扰动前后的途径通量变化计算出各酶的通量控制系数以确定关键酶。结果表明,该菌株乳酸合成途径中丙酮酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶对途径通量影响最大,由此预测在该菌株基础上进一步过表达这两个酶对提高乳酸生成速率可能最为有效。     

脂质代谢网通路关键基因调控牛肉品质的研究进展

牛肉蛋白质含量高, 脂肪含量低, 是人类消费的主要肉类食品之一。随着人们生活水平的日益提高, 对低胆固醇、低脂肪、高不饱和脂肪酸的肉类更为亲睐。而牛肉品质的优劣与机体脂质代谢关系密切, 脂质代谢多条途径交错成网状, 共同调控着牛肉品质。本文通过分析脂质代谢网络通路中对牛肉品质影响最大的胆固醇合成、胆固醇排出、甘油三脂合成三条通路中关键功能基因(PPARα、PPARγ、LXR、RXR、SREBP2)的作用及研究进展, 以期探索出通过调控脂质代谢而获得胆固醇含量低且甘油三脂含量低的优质牛肉的新途径, 不断满足消费者对高质量肉类的需求。     

酿酒酵母蔗糖关键代谢途径基因的敲除及其生长特性的变化分析

该研究以酿酒酵母（Sacchromyces cerevisiae）IMX581为出发菌株，利用Crispr-Cas9基因编辑的方法敲除其蔗糖消耗途径中的蔗糖转化酶基因Suc2和麦芽糖酶基因MAL32、MAL12、MAL22，构建工程菌株IMX581△Suc2和IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22，并对其生长特性及蔗糖消耗情况进行分析。结果表明，当初始OD600 nm值为0.1时，菌株IMX581△Suc2在以蔗糖为唯一碳源的培养基上仍然可以生长，但培养56 h时，生物量是出发菌株IMX581的52%，而菌株IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22几乎不生长。当初始OD600 nm值为0.1、5.0及10.0时，菌株IMX581△Suc2和IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22培养72 h后，蔗糖的消耗率较出发菌株IMX581均显著下降，分别为28.5%、35.5%、38.5%和7.0%、18.4%、22.5%。因此，成功构建了显著降低蔗糖消耗的菌株IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22，为研究酿酒酵母对蔗糖的利用及调控提供了参考。     

整合过表达嘌呤代谢途径关键酶基因提高酿酒酵母菌株环磷酸腺苷产量

调控嘌呤代谢途径关键酶基因表达水平,会影响经AMP→ADP→ATP而生成的c AMP(cyclic adenosine mnophosphate,c AMP)产量。将酿酒酵母编码磷酸核糖焦磷酸合成酶基因PRS1和PRS3、磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶基因ADE4、腺苷酸激酶基因ADK1,分别置于磷酸甘油酸激酶基因PGK1的启动子PGK1p和终止子PGK1t控制下,利用整合载体YIplac211,在菌株GA125中进行整合表达,通过摇瓶实验考察所得菌株的环磷酸腺苷产量。结果表明,在加腺嘌呤条件下,120 h时的c AMP产量分别为(5 380.5±1.91)、(5 189.4±1.72)、(5 131.8±2.05)和(5 199.9±1.62)μmol/L,较菌株GA125分别提高9.8%、5.9%、4.8%和6.2%;此外,ADK1过表达导致一定的生长抑制,所有菌株的腺嘌呤消耗量在(0.399±0.01)~(0.447±0.02)g/L,葡萄糖利用和乙醇产生上彼此没有呈现明显差异。     

Chemoprotective action of l-(+)-selenomethionine on the modulation of genes involved in oxidative stress and in the UPR pathway

The installation of oxidative process arises from an imbalance between oxidants and antioxidants compounds, in favor of excessive generation of free radicals. This process can affect cellular components, like endoplasmic reticulum (ER). The ER is extremely sensitive to changes in homeostasis, where, on different stimuli, may result in adaptation to survival or induction of apoptosis (unfolded protein response, “UPR” pathway). The oxidative damage caused by endogenous or exogenous agents or a dysregulation of the UPR pathway can lead to adverse conditions, whose chronicity has important implications for the etiology of chronic diseases, including cancer. Therefore, it becomes important to search for chemoprotective agents aiming their role in preventive medicine. Between these substances, selenium’s antioxidant activity seems to be effective in treating diseases which have the oxidative stress as its development. We evaluated the modulating action of l-(+)-selenomethionine (SeMet) in HepG2 cells against cellular stress induced by H₂O₂ through MTT assay, comet assay, and gene expression by qRT-PCR of genes related to oxidative stress, UPR pathway, and apoptosis. In MTT assay, the lower concentrations of SeMet showed a cytoprotective action against the damage caused by H₂O₂. Likewise, it was verified in the comet assay that the concentration of 50 ng/mL reduced the genotoxic damage caused by H₂O₂. SeMet at 50 ng/mL regulated the genes tested in the qRT-PCR, showing an antiapoptotic and antioxidant effect. These results suggest that SeMet positively modulates the genes of oxidative stress and ER, leading to a chemoprotective and antioxidant effect, becoming an alternative in preventive medicine.     

CRISPRi/ddCpf1促进大肠杆菌中丙二酰辅酶A的积累

丙二酰辅酶A是多种有价值化合物（包括食品、保健品等）合成的重要前体物质，其合成已成为大肠杆菌中生产目标代谢物的潜在瓶颈。为解决其生物合成的瓶颈问题，作者通过CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi） 促进丙二酰辅酶A的积累。首先，构建了丙二酰辅酶A的生物传感器，实现了其快速、可视化的胞内测量。随后，构建了CRISPRi/ddCpf1系统，实现了基因转录的抑制，并尝试用ddCpf1（催化失活的Cpf1）和RNA聚合酶抑制蛋白Gp2融合表达（CRISPRi/ddCpf1-Gp2）。结果表明，Gp2虽然有一定的转录抑制效果，但是严重影响了生长。最后，利用CRISPRi/ddCpf1系统进行两组双靶点基因抑制，分别靶向乙醛脱氢酶和3-氧代酰基-酰基载体蛋白合酶II基因，以及3-氧代酰基-酰基载体蛋白合酶I和琥珀酰辅酶A合成酶基因，均实现了丙二酰辅酶A浓度的提高。