肌原纤维蛋白磷酸化对其被μ-钙蛋白酶降解的影响

目的:研究肌原纤维蛋白磷酸化对其被μ-钙蛋白酶降解的影响。方法:以羊背最长肌肌原纤维蛋白为原料,添加蛋白激酶A和碱性磷酸酶催化磷酸化和去磷酸化反应,反应后加入μ-钙蛋白酶,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和荧光染色、蛋白质免疫印迹测定肌原纤维蛋白的磷酸化水平、蛋白降解程度。结果:蛋白激酶A处理组肌原纤维蛋白磷酸化水平显著高于对照组(P0.05);碱性磷酸酶处理组肌原纤维蛋白磷酸化水平显著低于对照组(P0.05);蛋白激酶A处理抑制μ-钙蛋白酶自溶,降低其活性,延长其发挥活性的时间;蛋白激酶A处理促进肌球蛋白重链及肌钙蛋白T降解;碱性磷酸酶处理促进肌动蛋白及肌间线蛋白降解。结论:磷酸化通过作用于μ-钙蛋白酶活性及肌原纤维蛋白进而影响μ-钙蛋白酶降解肌原纤维蛋白。     

温度、pH值对离体模型中肌原纤维蛋白去磷酸化反应的影响

研究温度（25、15 ℃和4 ℃）和pH值（5.2、5.8、6.4）对碱性磷酸酶活性及催化去磷酸化反应能力的影响,为改善肉品质提供理论依据。提取宰后羊肉中的肌原纤维蛋白建立离体模型,添加碱性磷酸酶催化肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Pro-Q Diamond磷酸化蛋白染色和SYPRO Ruby全蛋白染色测定肌原纤维蛋白磷酸化水平,试剂盒测定碱性磷酸酶活性。结果表明,随着孵育时间延长,pH 5.8和pH 6.4条件下碱性磷酸酶组肌原纤维蛋白磷酸化水平显著下降（P＜0.05）,pH 5.2条件下碱性磷酸酶组肌原纤维蛋白磷酸化水平无显著变化（P＞0.05）。对照组肌原纤维蛋白磷酸化水平在整个孵育期间无显著变化（P＞0.05）;4 ℃、pH 5.2条件下显著抑制（P＜0.05）碱性磷酸酶活性,使其催化去磷酸化时间延迟。测定碱性磷酸酶磷酸化水平发现,碱性磷酸酶不仅可以催化肌原纤维蛋白发生去磷酸化反应,也能催化其自身发生去磷酸化反应,且碱性磷酸酶自身发生去磷酸化后不会失活。因此在一定范围内升高温度和pH值会提高碱性磷酸酶催化底物去磷酸反应的能力,降低磷酸化水平,且使去磷酸化时间提前,为改善肉品质及肉贮藏提供新思路。     

肌动球蛋白磷酸化对其解离的影响

目的:研究改变肌动球蛋白粗提物磷酸化水平对其解离程度及ATPase活性的调控作用。方法:以肌动球蛋白粗提物为材料,添加蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)改变蛋白的磷酸化水平(4℃孵育48 h),通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光染色、蛋白质免疫印迹、ATPase活力测定试剂盒测定蛋白的磷酸化水平、游离肌动球蛋白含量和肌动球蛋白ATPase活力随孵育时间的变化。结果:PKA处理组蛋白样品中的肌钙蛋白T和肌球蛋白调节轻链的磷酸化水平显著高于对照组(P0.05),游离肌动蛋白含量显著高于对照组,且在0~2 h显著升高,2~48 h缓慢升高;肌动球蛋白ATPase活力显著低于对照组(P0.05),其活力随孵育时间延长显著升高(P0.05);AP处理组的变化则与之相反。结论:肌钙蛋白T、肌球蛋白调节轻链的磷酸化降低了肌球蛋白与肌动蛋白之间的相互作用力(肌动球蛋白ATPase活力低),从而促进肌动球蛋白的解离。     

羟自由基氧化对高白鲑肌原纤维蛋白降解的影响

为了探究羟自由基氧化对鱼肉宰后贮藏期间肌肉蛋白降解的影响,以高白鲑为研究对象,取其背部肌肉进行氧化,研究羟自由基氧化对高白鲑肌原纤维蛋白降解的影响。设置4 组不同浓度的氧化体系（1 mmol/L H2O2＋0.2 mmol/L FeCl3、5 mmol/L H2O2＋0.4 mmol/L FeCl3、10 mmol/L H2O2＋0.8 mmol/L FeCl3、20 mmol/L H2O2＋1.0 mmol/L FeCl3）,并分别室温氧化0、15、30、60、90 min,以羰基含量确定最适氧化浓度和时间;氧化样品于4 ℃贮藏,分别在0、1、7、14 d取样,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质免疫印迹检测肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）、肌动蛋白、肌间线蛋白和肌钙蛋白T等蛋白的降解程度。结果表明：5 mmol/L H2O2＋0.4 mmol/L FeCl3的氧化浓度下孵育60 min为本实验最适氧化条件;氧化组MHC的降解率比未氧化组高,羟自由基氧化显著促进了MHC的降解（P＜0.05）;肌动蛋白变化不显著（P＞0.05）,自然降解占主导地位;氧化组中肌间线蛋白和肌钙蛋白T的降解率低于未氧化组,羟自由基氧化抑制了肌间线蛋白和肌钙蛋白T的降解。综上所述,羟自由基氧化主要促进肌纤维中粗丝蛋白的降解,对细丝蛋白的降解没有明显影响,对细胞骨架蛋白和连接蛋白的降解起到抑制作用。     

低分子量褐藻多糖的制备及其活性分析

利用抗坏血酸协同过氧化氢法降解褐藻多糖,以DPPH自由基清除率为指标,通过工艺优化得到最佳降解条件,然后用超滤技术将降解产物进行分级,获得不同分子量组分,并分析其DPPH自由基清除率、保湿效果,酪氨酸酶抑制率等活性。正交试验结果表明,最佳降解条件为H₂O₂-V_C浓度20 mmol/L、降解温度45 ℃、降解时间3 h,在此条件下获得的降解产物的DPPH自由基清除率达到61.23%,降解产物得率为73.16%。电泳结果表明,降解后的褐藻多糖的条带明显出现在低分子量区。利用超滤系统将降解产物分级为<5 kDa、5~10 kDa、10~30 kDa、>30 kDa四个不同分子量段的组分,研究发现各分子量段之间的活性存在显著差异（P<0.05）,尤其<5 kDa组分（其主要成分为2.140×103 Da,占比29.6%）的活性最好,其DPPH自由基清除率为59.27%,60 h后保湿率为75.75%,酪氨酸酶抑制率为65.28%。与褐藻多糖相比,其糖醛酸含量稍有下降。本研究结果可为褐藻多糖在功能性食品等领域的应用提供理论依据。     

LAMP在乳品厂耐热菌检测中的应用

好热黄无氧芽孢菌和凝结芽孢杆菌是乳品中常见的污染菌。为了检测该两种菌,以spo0A基因片段为靶基因,通过序列比对,设计出环介导等温扩增技术(LAMP)引物,对spo0A基因部分序列进行了扩增,并对反应温度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度及Mg2+浓度等扩增条件进行优化。结果表明:在温度63℃,甜菜碱浓度0.6 mol/L,dNTPs浓度1.0mmol/L、Mg2+浓度6.0mmol/L时,反应体系孵育30～60min,扩增效果最佳,检测灵敏度能够达到51CFU/mL。     

牛磺酸降低高胆固醇HepG2细胞内胆固醇的作用机制研究

目的:探讨牛磺酸对高胆固醇Hep G2细胞胆固醇降解作用及其机制。方法:以0.02 mmol/L胆固醇加入培养液中建立高胆固醇细胞模型后,分别加入1、10、20 mmol/L牛磺酸培养48 h,测定细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)、胆固醇酯(EC)及细胞内总胆汁酸(TBAc)和培养液总胆汁酸(TBAm)水平;并检测20 mmol/L牛磺酸作用24 h后细胞CYP7A1及其调控分子的蛋白表达水平。结果:10 mmol/L和20 mmol/L牛磺酸作用48 h可显著降低细胞内TC、FC和EC(p0.01),同时升高了TBAc和TBAm(p0.05或p0.01);20 mmol/L牛磺酸作用24 h时使CYP7A1显著增加(p0.05);20 mmol/L牛磺酸作用24 h后MAPK、ERK、JNK、c-jun和p-c-jun表达明显降低(p0.05),而对HNF4α则无显著影响。结论:牛磺酸可抑制高胆固醇Hep G2细胞MAPK/ERK和MAPK/JNK表达水平,降低c-jun蛋白表达及c-jun磷酸化水平,促进CYP7A1蛋白表达升高,从而加速胆固醇转化为胆汁酸。     

重组过氧化物酶A4-Prx酶学特性及其降解DDGS中ZEN的研究

初步研究了一种重组过氧化物酶Acinetobacter sp.SM04(A4-Prx)的酶学特性,并先对pH、温度和H2O2浓度对过氧化物酶A4-Prx活性的影响进行单因素优化,然后采用正交实验设计对A4-Prx降解玉米酒糟中玉米赤霉烯酮的反应条件进行了优化。结果表明,重组过氧化物酶A4-Prx不含有血红素,其过氧化物酶活性的最适pH、温度和H2O2浓度分别为pH8.5、75℃、25mmol/L;A4-Prx降解DDGS中ZEN的最佳反应条件为:H2O2浓度40mmol/L,料液比1:2(g/mL),温度70℃,时间9h,且在该条件下ZEN降解率为99.2%±0.2%。     

枸杞提取物对骨质疏松症大鼠的改善作用

为了探究枸杞提取物能够对骨质疏松症状起到改善效果,本文通过实验,根据枸杞提取物的浓度和各项指标增减变化,来探讨其对骨质疏松症大鼠症状的改善作用。选取80只符合实验要求的雌性大鼠平均分为两组,对其中一组进行去除卵巢手术,构建骨质疏松大鼠模型,采用水提法提取不同浓度的枸杞提取物,对各组大鼠实施不同浓度枸杞提取物和生理盐水的灌胃处理,70d后处死大鼠并检测各项相关指标。研究结果表明,枸杞提取物可有效提升骨质疏松大鼠骨密度约为0.05g/cm、转化生长因子-β1约为28.15μg/mL、一氧化氮约为7.05μmol/L、一氧化氮合酶约为8.23 U/mL、磷离子约为0.05 mmol/L以及骨钙素约为0.13 nmol/mL,且枸杞提取物浓度与各指标提升呈正向增长;枸杞提取物可有效降低骨质疏松大鼠血清中钙离子约为0.15 mmol/L、镁离子约为0.10mmol/L、碱性磷酸酶约为13.17 U/L以及免疫调节因子白细胞介素-6约为12.75μg/mL、肿瘤细胞坏死因子-α约为1.06μg/mL;且枸杞提取物浓度与各指标降低呈反向增长。说明枸杞提取物可有效调节骨质疏松大鼠身体中细胞因子,缓解大鼠骨分解情况,达到治疗骨质疏松目的。     

卵转铁蛋白和乳铁蛋白的氧化稳定性的比较研究

分析比较了卵转铁蛋白(Ovotransferrin,OVT)和乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)的氧化稳定性。采用SDS-PAGE、蛋白溶解度、总巯基含量及羰基含量等检测方法,研究了OVT和LF在AAPH(2,2'-azobis(2-amidinopropane)hydrochloride)作用下的结构变化,以及其对ABTS和DPPH自由基的清除率。SDS-PAGE的结果表明:当AAPH浓度为5 mmol/L时,LF在较高分子量区域开始出现新条带;当AAPH浓度为20 mmol/L时,OVT在较低分子量区域(31~43 ku)才出现新条带;随着AAPH浓度进一步增大,OVT和LF主要条带密度明显降低,经AAPH作用后出现的新条带的密度都逐渐增高。当AAPH(20 mmol/L)作用1 h时,LF即在较高分子量区域出现新条带;在4 h时,OVT才在较低分子量区域出现新条带。当OVT和LF的浓度为2 mg/m L时,AAPH(20 mmol/L)可致OVT和LF同时出现新条带;LF随其浓度增大,在较高分子量区域出现的新条带的密度逐渐降低;OVT在4 mg/m L以上时,在较低分子量区域的新长带已不可见。随着AAPH(20 mmol/L)的作用时间延长(1~8 h),OVT和LF的溶解度、总巯基含量均逐渐下降,羰基含量均逐渐升高(p0.05)。OVT和LF对ABTS和DPPH自由基清除率随着蛋白浓度增大而逐渐增大(p0.05)。综上所述,LF较OVT更容易被AAPH氧化导致结构改变。     

蛋白质氧化对高白鲑肌浆蛋白理化特性的影响

以新疆塞里木湖高白鲑为研究对象,研究高白鲑肌肉蛋白经FeCl3/H2O2/Asc羟自由基氧化系统氧化后,蛋白理化特性的变化情况。结果表明,高白鲑肌浆蛋白（sarcoplasmic proteins,SP）的羰基含量、二聚酪氨酸含量、表面疏水性与氧化剂浓度（1～20?mmol/L）和时间（1～5?h）呈正相关,总巯基含量、游离氨基相对含量和Ca2＋-ATPase活性与氧化剂浓度和氧化时间呈负相关,各指标变化差异显著（P＜0.05）。与氧化剂H2O2（20?mmol/L）氧化作用5?h后,与未氧化组相比,羰基含量增加了41.28%,二聚酪氨酸含量增加了39.5%,表面疏水性增加37.5%,总巯基含量减少了65.9%,Ca2＋-ATPase活性降低了60.2%,游离氨基含量降低了22.5%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定从分子水平上反映出H2O2氧化造成蛋白聚合物的形成和蛋白降解。结果表明,蛋白氧化和SP的物化特性的改变对高白鲑SP的质量有影响。     

Ca2+、ATP、ADP和AMP对鸭胸肉中肌动球蛋白解离的影响

为了解促进肌动球蛋白解离的因素,从鸭胸肉中提取肌动球蛋白,研究Ca2+、三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate,ATP）及其降解产物对肌动球蛋白的解离效果。通过蛋白质免疫印迹技术测定肌动蛋白含量的变化来研究肌动球蛋白的解离情况。研究发现,7.5～64 mmol/L Ca2+对肌动球蛋白的解离无促进作用（P＞0.05）,而Ca2+浓度升高到200 mmol/L时,能显著促进肌动球蛋白的解离（P＜0.05）;单独的ATP对肌动球蛋白的解离无促进作用（P＞0.05）;Ca2+和ATP共同作用于肌动球蛋白后,可显著促进肌动球蛋白的解离（P＜0.05）;二磷酸腺苷（adenosine diphosphate,ADP）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）均可显著促进肌动球蛋白的解离（P＜0.05）,且不同浓度处理组间无显著性差异（P＞0.05）。因此,可以推断ADP、AMP以及Ca2+和ATP的共同作用对肌动球蛋白的解离有促进作用。     

钙离子交联对β-胡萝卜素乳液水凝胶微粒的影响

制备β-胡萝卜素蛋白乳液,在此基础上构建β-胡萝卜素乳液水凝胶微粒,加入不同浓度的Ca2＋进行交联,对Ca2＋交联β-胡萝卜素乳液水凝胶微粒的基本性质及稳定性进行考察。经浓度为0～4 mmol/L的Ca2＋交联的水凝胶微粒粒径无显著性差别;随着Ca2＋浓度的增加,水凝胶微粒的黏度及凝胶强度增加;经Ca2＋交联的水凝胶微粒的离心稳定性提高。β-胡萝卜素乳液在pH 3～5发生严重的分层现象,而β-胡萝卜素乳液水凝胶微粒在pH 3～7之间都相对较稳定。Ca2＋交联浓度为0～2 mmol/L的水凝胶微粒在高NaCl浓度（＞2 mol/L）时会出现分层现象,但是Ca2＋交联浓度为2～4 mmol/L的水凝胶微粒可以在不同NaCl浓度下一直保持稳定。在贮藏稳定性实验中,Ca2＋交联可以进一步提高水凝胶微粒对β-胡萝卜素的保护。     

氯化钙对食品致腐荧光假单胞菌生物被膜形成的影响

研究氯化钙（CaCl2）对食品腐败株荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物被膜形成特征的影响。采用结晶紫法、菌体计数、苯酚-硫酸法、共聚焦扫描显微镜和实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测Ca2＋对荧光假单胞菌的生物被膜形成、多糖分泌、被膜结构及相关基因表达的影响。结果表明,0.1 mmol/L Ca2＋刺激荧光假单胞菌生物被膜,随着浓度增加被膜形成增强,其中1 mmol/L促进最明显,而高于10 mmol/L作用减弱,并且Ca2＋不影响浮游细菌生长;同时,0.1 mmol/L和1 mmol/L Ca2＋对胞外多糖、薄膜和泳动性均呈现促进效果,而高浓度下呈现抑制;共聚焦扫描显微镜观察荧光假单胞菌对照组、1 mmol/L和20 mmol/L Ca2＋处理组的成熟生物被膜厚度分别为20.0、40.0 μm和25.0 μm,其中添加1 mmol/L Ca2＋显著增加PF07被膜厚度、菌体和胞外聚合物分泌量,使被膜结构更致密;实时荧光定量PCR检测显示,1 mmol/L Ca2＋刺激菌体黏附素lapA、藻多糖alg、鞭毛flgA基因表达量增加3～4 倍,并且Ca2＋均显著刺激AHLs合成酶luxI基因的表达,提示Ca2＋影响生物被膜与群体感应密切相关。可见,食品介质中CaCl2通过影响菌体黏附行为、胞外分泌物、基因表达导致荧光假单胞菌生物被膜形成特征和结构的改变,该研究为复杂的食品介质中腐败菌生物被膜形成和黏附提供依据。     

金银花过氧化物酶的三相分离纯化及酶学性质

采用三相分离法提取纯化金银花中过氧化物酶,结果表明最优纯化条件为pH?5.60、硫酸铵质量浓度39.49?g/100?mL、提取液与叔丁醇体积比1∶1.38,在该条件下纯化倍数为5.849,回收率为87.64%。金银花过氧化物酶比活力为1 021.6 U/mg,色素清除率为92%;酶学性质研究表明:金银花过氧化物酶最适温度为30℃,热稳定范围为10~40℃;最适pH值为5,pH值稳定范围为4~7。在金银花过氧化物酶催化的双底物酶促反应中,当H_2O_2浓度一定时,酶对愈创木酚的Km值为8.12?mmol/L,vmax值为1.71?mmol/(min·L)。当愈创木酚浓度一定时,H_2O_2的Km值为0.822?mmol/L,vmax值为1.38?mmol/(min·L)。金银花过氧化物酶与底物的亲和力由强到弱依次是邻苯三酚、邻苯二酚、联甲氧基苯胺、愈创木酚。Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)对金银花过氧化物酶有激活作用,Mg~(2+)、Mn~(2+)、柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、十二烷基磺酸钠对金银花过氧化物酶有不同程度的抑制作用。     

Changes in degradation and phosphorylation level of titin in three ovine muscles during postmortem

The objective of this study was to investigate the degradation of titin and its phosphorylation level in three muscles from sheep. The MFI and pH from the longissimus lumborum (LL), semimembranosus (SM) and psoas major (PM) muscles were measured at 30 min, 1, 2, 7, 14, 21 and 28 days postmortem. Myofibrillar proteins were extracted, separated by SDS‐PAGE and quantified by phosphor‐specific staining. Phosphorylation of titin was predicted by Pro‐Q Diamond‐SYPRO Ruby staining. Two days after exsanguination, the pH and MFI of the PM were higher than those of the LL and SM muscles (P < 0.05). The sarcomere length of the PM muscle was also longer than that of the LL and SM muscle (P < 0.05). PM muscles had a highest phosphorylation level (P < 0.05) at 0.5 h postmortem and showed the greatest degree of titin degradation over 28 days. This suggests that phosphorylation of titin might accelerate its degradation.     

产谷氨酸脱羧酶片球菌的鉴定及其酶学性质

从发酵蔬菜中分离一株产谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)的乳酸菌HS2,其菌体细胞转化Glu 1h,转化液中γ- 氨基丁酸含量可达(3.114 ± 0.133)g/L,通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育分析,鉴定菌株HS2 是戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。菌株HS2 GAD 最适作用温度为35℃,最适作用pH4.5。酶的热稳定较好,在pH4.0～6.5 于50℃处理4h,酶活基本稳定。Ca2+ 对酶有激活作用,5mmol/L 和50mmol/L Ca2+ 浓度使酶活分别提高了37.21% 和23.02%。Mg2+ 和Mn2+ 在50mmol/L 浓度时激活作用明显,而Co2+在5mmol/L 浓度激活作用较好。     

基于黄嘌呤氧化酶活性抑制和斑马鱼高尿酸血症模型的降尿酸功效食药材筛选

结合体外（黄嘌呤氧化酶活性抑制）和体内（斑马鱼高尿酸血症模型）方法,对15种食药材乙醇粗提物的降尿酸活性进行筛选。体外实验设置空白组、酶反应组、抑制剂组、对照组,酶标仪295 nm测定吸光度,计算15种食药材对黄嘌呤氧化酶（XOD）活性的抑制率;体内实验随机选取受精后第5 d（5dpf）的斑马鱼,设置空白组、模型组（200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS）、食药材给药组（200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS+不同浓度提取物）、阳性对照组（200 μmol/L PO+10 μmol/L XSS+APL 2 mmol/L）,水溶浸泡,28.5 ℃培养箱中孵育24 h,测定尿酸含量,对具有良好XOD抑制活性的食药材做进一步降尿酸活性验证。体外试验结果表明,15种乙醇粗提物均具有XOD抑制活性,其中8种在400 μg/mL时抑制率达到50%以上,分别为:红景天、兔耳草、牡丹皮、败酱草、黄柏、绿萝花、决明子、雪菊。体内试验结果表明,8种处理组尿酸水平与模型组相比显著降低（P<0.05或P<0.01）,均显示出降尿酸活性。