一种检测发酵乳中嗜酸乳杆菌的定量定性方法

根据乳酸菌的16S rDNA基因序列设计嗜酸乳杆菌种特异性引物,应用种特异性PCR和实时荧光定量PCR反应,通过琼脂糖凝胶电泳图谱和实时荧光定量PCR图谱分析,建立快速、准确地检测发酵乳中L.acidophilus的定量和定性方法。     

实时荧光定量PCR技术在乳酸菌定量检测中的应用

与传统的菌落计数、杂交技术及PCR技术等相比,实时荧光定量PCR技术作为一种检测和定量微生物的方法,具有较高的灵敏度及可重复性,而且反应过程快速,污染较小.作者综述了实时荧光定量PCR技术的定量原理,荧光检测物质,目的基因序列以及其特点,并且列举了在乳酸菌定量检测中的应用,同时对其应用前景进行了展望.     

酸乳中乳杆菌和链球菌的实时荧光定量分析

采用实时荧光定量分析了酸乳中的德氏乳杆菌L2和嗜热链球菌S1的数量,德氏乳杆菌L2的活菌数与细胞循环数的相互关系曲线为Y=-2.936logX+34.72(R2=0.998),采用平板计数法获得的样品中L2浓度为8.82×10smL-1,荧光定量的结果是8.78×108mL-1;嗜热链球菌S1活菌数与细胞循环教的相互关系曲线为Y=-3.03910gX+35.45(R2=0.995),采用平板计数法,获得的样品中嗜热链球菌S1浓度1.08×108mL-1,荧光定量的结果是1.06×108mL-1.实时荧光定量的方法适合于酸乳中乳酸菌的快速计数.     

嗜酸乳杆菌NCFM黏附定植能力的研究

采用实时定量(Real-time)PCR的方法对嗜酸乳杆菌NCFM在小鼠肠道中的定植情况进行了评价。通过研究发现,实时定量(Real-time)PCR用来菌数的评估具有非常好的线性关系和稳定性。小鼠灌胃一周的过程中,在小鼠的十二指肠、回肠、空肠、盲肠、结肠和粪便中菌体的数量并没有出现数量级上的增长或减少,说明我们灌胃的菌体浓度适当,并没有引起小鼠体内的菌群失调。而在灌胃第1 d,基本上各部分的肠组织和粪便中菌体的数量都有增加,说明灌胃初期菌体在肠道中有较好的定植。而第3、5和7 d小鼠肠道和粪便中的菌体数量上下波动,但并没有显著地增加或减少,说明小鼠体内的菌群数量达到了一个平衡,并不会因为持续灌胃就打破这个平衡。因此,嗜酸乳杆菌NCFM具有良好的定植能力。     

实时荧光定量PCR检测产琥珀酸丝状杆菌数量方法的研究

为建立产琥珀酸丝状杆菌定性定量研究方法,实现后期该菌种用于纤维素生物可再生能源等方面应用研究。本试验提取15份瘤胃细菌脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA),利用SYBR Premix Ex Taq荧光染料嵌合法和人工合成基因技术,采用实时荧光定量PCR方法检测样品中产琥珀酸丝状杆菌数量;结果:所构建的质粒DNA标准曲线线性关系良好,R2=1,所有样品溶解曲线均为单峰,扩增曲线呈S型,扩增效率为93.9%。表明应用构建实时荧光定量PCR法可对实际样品中产琥珀酸丝状杆菌进行定性定量研究。     

植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法

根据已报道的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的23S rRNA基因保守序列,设计用于检测植物乳杆菌的特异性DPO(dual priming oligonucleotide)引物,结合SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术,建立植物乳杆菌的DPO引物实时荧光PCR检测方法,对其特异性和灵敏度进行了评价,并将建立的检测方法用于实际样品的检测中。结果显示,该方法对2株植物乳杆菌能得到阳性扩增,其余11株乳酸菌及阴性对照没有扩增曲线,灵敏度高达0.001 ng/μL,而且在退火温度为50~60℃范围内不影响其特异性,表明该方法对退火温度不敏感;用微生物菌制剂和酸奶共13种益生菌产品进行了验证,检出情况与产品标识一致。因此,该研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR能够快速、准确、高效地检测微生物菌制剂及其他益生菌产品中的植物乳杆菌。     

实时荧光定量PCR技术在食用油脂检测中的应用

荧光定量PCR检测技术具有快速、准确的优点,在转基因食品检测等领域得到了广泛的应用。采用荧光定量PCR技术进行油脂转基因、掺假检测也成为研究热点。利用不同油料作物所含有的独特核酸序列,采用荧光定量PCR技术可简单、高效、快速地检测出油脂中所含的特定核酸成分,从而判定油脂原料的构成,为打击食用油脂掺假造假提供判定依据。植物油的加工过程中都经过多个步骤的处理,其中的核酸降解严重,含量极低,所以从植物油中提取出较高质量的DNA是对油脂进行荧光定量PCR检测鉴定的关键。本文主要对油脂DNA提取方法及存在的难点、引物设计特点和结果分析进行了论述,以期为今后荧光定量PCR检测技术进一步推广与应用提供思路。     

中药材浙贝母的实时荧光定量PCR方法研究

目的:探讨荧光定量PCR对浙贝母鉴别的可行性。方法:采用实时荧光定量PCR法从试样中提取DNA,进行引物扩增,并通过Cq值和扩增曲线对样品进行判断。结果:4批浙贝母的Cq值均低于30,曲线有明显的指数增长期;平贝母、川贝母和土贝母则无Cq值,曲线为一直线。结论:本方法用于鉴别浙贝母操作简单,准确率高,重现性好,可行有效。     

荧光PCR方法定量检测食品中香菇成分

摘要：【目的】为辨别出口商品和国内市场中谎报香菇成分、以次从好的菌菇产品，准确核定菌菇产品的价格，打击出口骗税等不法行为，特应急研究开发本方法。【方法】选取香菇基因组单拷贝核基因Hydrophobin Protein基因，设计香菇种属特异性引物，扩增107 bp的片段，用于荧光PCR定量检测。分别以3种香菇作为阳性对照和14种非香菇菌种、植物产品作为阴性对照，测试实时荧光PCR引物和探针的特异性。以香菇标准DNA进行8个浓度梯度稀释，测试本定量方法绝对定量限。制备12个梯度含量的香菇DNA样品，测试香菇相对含量的标准曲线。【结果】结果表明本研究建立的香菇荧光PCR定量检测方法对香菇物种的特异性好，与其他食物物种无交叉结果，荧光PCR扩增效率为0.90，绝对定量限LOQ为0.01 ng和含量检测LOQ为0.05％。【结论】本方法重复性和实用性好，可以满足食品和调味料中香菇含量定性定量检测要求。     

基于实时荧光PCR对肉制品中羊肉的精确定量

该研究将实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence quantitative PCR,r PCR)与微滴式数字PCR技术(micro-droplet digital PCR,dd PCR)相结合,利用dd PCR建立拷贝数和羊肉质量的函数关系,确立了基于r PCR定量检测羊肉含量的方法。特异性实验结果表明,除绵羊和山羊外,非目标物种DNA未出现特异性扩增;灵敏度实验结果表明,该方法的最低检出限为0. 01 ng/μL;通过对已知成分的混合样品和市售样品的检测表明,该方法能够对含量在5%以上的羊肉进行准确定量。因此,该方法在肉制品中羊肉含量检测和掺假鉴别方面具有较好应用潜力。     

食品中乳酸杆菌的实时荧光PCR的快速检测

本文运用实时荧光PCR(Real-time PCR)技术建立了对食品中常见的乳酸杆菌进行检测的快速方法.针对乳酸杆菌16S rDNA序列,设计了通用引物和特异性探针,进行TaqManTM实时PCR检测,以非同源性参考菌株做特异性检测;把乳酸杆菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.实验结果表明用实时荧光PCR法检测乳酸杆菌,快速、敏感、特异性高.     

Innovative Methods for Removal of PCR Inhibitors for Quantitative Detection of Plesiomonas shigelloides in Oysters by Real-Time PCR

A quantitative assay for Plesiomonas shigelloides in pure culture and oysters based on the real-time polymerase chain reaction (Rti-PCR) was developed. The methodology involved the treatment of oyster tissue homogenates with formaldehyde, differential centrifugation, and treatment of samples with activated charcoal coated with Pseudomonas fluorescens. With seeded oyster tissue homogenates, without formaldehyde or coated charcoal treatments, the lowest level of detection for P. shigelloides was 1?×?10⁷ genomic targets per gram of tissue, equivalent to 2.5?×?10⁵ genomic targets per Rti-PCR. The addition of 4% formaldehyde to tissue homogenates reduced the minimum level of detection of P. shigelloides to 1?×?10⁵ genomic targets per gram of tissue, equivalent to 2.5?×?10³ genomic targets per real-time PCR. The treatment of tissue homogenates with only activated charcoal coated with P. fluorescens reduced the minimum level of detection of P. shigelloides to 1?×?10⁴ genomic targets per gram, equivalent to 2.5?×?10² genomic targets per real-time PCR, without DNA purification or enrichment. The combination of adding 4.0% formaldehyde to oyster tissue homogenates and treating with coated charcoal reduced the level of detection of P. shigelloides to 1?×?10³ genomic targets per gram, equivalent to 25 genomic targets per real-time PCR. The linear range of detection was from 1?×?10³ to 1?×?10⁶ genomic targets per gram without enrichment.     

Innovative Methods for Removal of PCR Inhibitors for Quantitative Detection of Plesiomonas shigelloides in Oysters by Real-Time PCR

A quantitative assay for Plesiomonas shigelloides in pure culture and oysters based on the real-time polymerase chain reaction (Rti-PCR) was developed. The methodology involved the treatment of oyster tissue homogenates with formaldehyde, differential centrifugation, and treatment of samples with activated charcoal coated with Pseudomonas fluorescens. With seeded oyster tissue homogenates, without formaldehyde or coated charcoal treatments, the lowest level of detection for P. shigelloides was 1 × 10⁷ genomic targets per gram of tissue, equivalent to 2.5 × 10⁵ genomic targets per Rti-PCR. The addition of 4% formaldehyde to tissue homogenates reduced the minimum level of detection of P. shigelloides to 1 × 10⁵ genomic targets per gram of tissue, equivalent to 2.5 × 10³ genomic targets per real-time PCR. The treatment of tissue homogenates with only activated charcoal coated with P. fluorescens reduced the minimum level of detection of P. shigelloides to 1 × 10⁴ genomic targets per gram, equivalent to 2.5 × 10² genomic targets per real-time PCR, without DNA purification or enrichment. The combination of adding 4.0% formaldehyde to oyster tissue homogenates and treating with coated charcoal reduced the level of detection of P. shigelloides to 1 × 10³ genomic targets per gram, equivalent to 25 genomic targets per real-time PCR. The linear range of detection was from 1 × 10³ to 1 × 10⁶ genomic targets per gram without enrichment.     

实时荧光定量PCR技术在食品微生物检测和研究中的应用

实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧：艺讯号强度来达到定量的目的,不仅实现了对核酸信息量的分析比较,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,近年来该技术开始作为食品微生物的研究手段。本文概述了实时荧光定量PCR技术的原理、优缺点及其在食品微生物检测中的应用与研究进展,并探讨了它的技术发展和应用前景。     

实时荧光定量PCR法测定发酵乳中双歧杆菌

对实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测发酵乳中双歧杆菌的DNA提取方法、PCR扩增效率、标准曲线绘制进行探讨,通过比较分析碱式提取法、玻璃珠破碎法和酶解法3种提取方法对发酵乳中总DNA提取效率、4种不同参考菌株的PCR扩增效率以及单一菌株标准曲线与混合菌株标准曲线的计数结果,建立实时荧光定量PCR快速测定发酵乳制品中双歧杆菌数量方法。结果表明：酶解法提取发酵乳中总DNA效果最好,OD260/280比值基本接近1.80,且提取的质量浓度含量最高;不同菌株的PCR扩增效率不同,其中参考菌株1.2213的Ct值与其他3菌株的Ct值存在显著性差异;根据单一菌株绘制标准曲线与混合菌株绘制标准曲线计数结果无显著性差异,后者计数结果更客观、准确。采用酶解法获取样品中的菌体细胞,基于混合菌液绘制标准曲线,采用实时荧光定量PCR技术确定发酵乳中双歧杆菌种属数量,可快速、准确地测定发酵乳中双歧杆菌的数量。     

副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法的建立

目的:构建肉制品副溶血性弧菌实时荧光定量PCR的标准阳性模板和检测方法.方法:以副溶血性弧菌toxR基因上特异性片段为目标,设计并合成引物及Taqman探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性.结果:构建出副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法的标准模板并建立了相应的检测方法,获得的标准曲线方程为:Y=-3.151 lgX+42.86,灵敏度40copies/反应体系,对副溶血性弧菌具有特异性,同时,该方法具有良好的重复性,变异系数小于5％.结论:使用基于Taqman探针技术的荧光定量PCR检测方法能够对食品中致病性副溶血性弧菌进行快速、简便、准确、高效的定量检测.     

通用型酵母菌实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测鉴定食品中酵母污染菌实时荧光PCR法,根据酵母基因序列设计出通用型探针和引物,建立了运用实时荧光PCR法检测酵母的反应体系和反应条件,进而对该方法进行特异性验证,灵敏度分析及稳定性评价,并应用于产品样本的检测。特异性试验表明,酵母菌检测结果均为阳性,而细菌、霉菌均为阴性,荧光PCR检测结果的特异性为100%。灵敏度试验表明,酵母菌检出限在760 cfu/m L。稳定性试验表明,酵母菌组内实验CV在0.62~0.81%之间波动,而组间实验在0.43~0.77%之间波动。通过样品增菌检测发现在培养12 h后能检出阳性。本研究所建立的实时荧光PCR法特异性好、灵敏度高、稳定性好,具有快速、简便的特点,为快速检测食品中酵母污染提供新的方法和途径,具有很好的研究价值和应用前景。     

SYBR Green实时荧光定量PCR检测大豆转基因成分

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,建立了食品中大豆转基因成分的定量检测方法。通过设计特异引物,扩增内源参照基因lectin和转基因靶基因CP4EPSPS,建立两种基因的拷贝数-CT标准曲线,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量,并且通过熔解曲线分析扩增反应特异性。结果表明,lectin和CP4EPSPS基因标准曲线线性关系好,R2值分别为0.9984和0.9953,方法的回收率为95%～110%,检测限为0.01%。本检测方法具有快速、灵敏、准确、特异、高通量等优点,可以作为食品中大豆转基因成分的定量检测方法。     

乳品检测中实时荧光定量PCR仪的研制

完成了荧光检测系统、PCR热循环扩增系统、DNA核酸定量分析诊断系统等仪器关键技术研究，针对乳品检验及临床应用要求．在国家权威部门完成了仪器性能检测、使用验证、临床试验等全过程，实现了产品化和应用示范，并达到了准确性、安全性和有效性的要求。