两阶段溶氧控制及FeSO_4添加对谷氨酸棒杆菌合成4-羟基异亮氨酸的影响

优化4-羟基异亮氨酸发酵过程中溶氧水平及FeSO_4添加量,以提高其发酵水平。结合菌株Corynebacterium glutamicum HIL18及4-羟基异亮氨酸合成特点,首先考察不同溶氧水平及两阶段溶氧控制对4-羟基异亮氨酸发酵的影响。然后考察FeSO_4添加对其发酵的作用。20%溶氧有利于4-羟基异亮氨酸的合成。利用两阶段溶氧控制工艺(0～20 h、20%溶氧;20～64 h、30%溶氧)经64 h发酵,4-羟基异亮氨酸产量达到38.7 g/L,较未使用该工艺提高11.2%。采用两阶段FeSO_4添加策略(初始浓度为65μmol/L、20 h添加30μmol/L),4-羟基异亮氨酸的产量达到43.4 g/L。采用优化后的工艺使得4-羟基异亮氨酸产量较优化前提高27.3%。获得了4-羟基异亮氨酸发酵过程中两阶段溶氧控制及FeSO_4添加工艺。该结果为4-羟基异亮氨酸的高效发酵合成提供参考。     

过表达mqo对重组谷氨酸棒杆菌L-异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸合成的影响

4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)具有促进胰岛素分泌、降低胰岛素抵抗活性功能,在治疗糖尿病方面有潜在的应用价值。在产L-异亮氨酸(L-isoleucine,Ile)的谷氨酸棒杆菌SN01菌株中过表达ido基因后可以合成4-HIL。为了促进草酰乙酸的供应和4-HIL合成,在这株重组菌中又过表达了mqo。发酵144 h后,ido-mqo过表达菌的4-HIL产量是(60.86±2.24)mmol/L,低于ido过表达菌(72.06±5.60)mmol/L;但是,Ile的积累量高达(101.39±2.20)mmol/L,显著高于ido过表达菌(5.00±1.43)mmol/L。对ido-mqo过表达菌代谢途径中部分关键基因的RT-PCR分析表明,进入TCA循环的碳流由异柠檬酸裂解酶分流,进入乙醛酸循环,导致4-HIL合成所需的另一底物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)供应不足和Ile过剩。于是添加α-KG,当添加量为40 mmol/L时,4-HIL的产量提高到(77.7±10.91)mmol/L,Ile到4-HIL的转化率提高到75%。因此,过表达mqo能够促进Ile合成,添加α-KG后能够促进Ile向4-HIL转化,从而提高4-HIL产量。     

生物法合成4-羟基异亮氨酸的代谢工程研究进展

4-羟基异亮氨酸是一种非蛋白质氨基酸,因具有血糖浓度依赖的诱导胰岛素分泌等生物学活性,而被视为治疗糖尿病的潜在药物.近年来,生物法合成4-羟基异亮氨酸取得了一定的进展.文章概述了4-羟基异亮氨酸的功能、合成方法及其生物合成途径.在此基础上,从构建4-异亮氨酸合成途径、强化L-异亮氨酸合成、重构中心代谢途径等层面着重阐述...     

动态调控谷氨酸棒状杆菌合成4-羟基异亮氨酸

4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine, 4-HIL)在治疗Ⅱ型糖尿病方面极具潜力。异亮氨酸双加氧酶(isoleucine dioxygenase, IDO)能够将L-异亮氨酸(L-isoleucine, Ile)转变成4-HIL。为提高重组谷氨酸棒杆菌的4-HIL产量同时降低副产物L-赖氨酸(L-lysine, Lys)的合成,首先将Lys-OFF核糖体开关整合到Lys合成途径的关键基因dapA序列上游,得到D-RS菌株。该菌株能够根据胞内外Lys的浓度,动态弱化Lys合成,使Lys的含量降低了46.7%。其次,在该菌株中再利用Ile激活型传感器Lrp-P_brnFEN去控制密码子优化后的ido基因的表达,使4-HIL的产量提高至116.3 mmol/L。最后,为了进一步提高4-HIL产量,利用强启动子P_brnFE7动态控制odhI和vgb的表达,增强α-酮戊二酸和O₂的供应。最终得到了1株摇瓶发酵4-HIL产量高达166.0 mmol/L,Lys含量降至6.5 mmol/L的重组菌株D-RS-     

4-羟基异亮氨酸无抗发酵的菌株构建和上罐条件优化

为了提高谷氨酸棒杆菌生产4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine, 4-HIL)的发酵水平和减少发酵过程中抗生素的使用,在菌株SN01中敲除丙氨酸消旋酶编码基因alr,向敲除菌中转入表达alr基因和ido基因的质粒pJYW4-ido进行回补,构建了菌株Δalr/p4-ido。试验表明该方法能够为细胞带来足够的筛选压力,发酵过程中无需使用抗生素就可以维持质粒存在和4-HIL合成。在alr敲除菌中转入质粒pJYW4-ido-lysC-ido3,构建出Δalr-ILI3无抗发酵菌株,并进行上罐发酵条件优化。首先接种不同生长时间的种子进行上罐发酵,结果表明生长时间为18 h的种子最适合生产4-HIL,发酵96 h后,生成242.18 mmol/L 4-HIL。其次进行溶氧水平的两阶段调整,发酵96 h生成269.20 mmol/L 4-HIL,较未优化前产量提高了11.2%。最后调整了补料方法,4-HIL的产量达到了324.72 mmol/L,较未优化前产量提高了34.1%。该方法为谷氨酸棒杆菌生产4-HIL的无抗发酵提供了思路,为实际生产中提高4-HIL的产量提供了参考。     

重组大肠杆菌全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸

4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E. coli BL21(DE3)中的异源表达。其次,通过同源建模和蛋白质结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成丙氨酸Ala的原则,对I156位点进行了定点突变,以增大底物结合口袋,扩宽底物通道进而提高4-HIL的产量。最后,对野生酶及突变酶的酶学性质、突变酶的羟基化反应体系进行研究,在最优催化条件下,分批补料转化底物进行4-HIL的生产。酶学性质结果显示,野生酶及突变酶I156A的最适温度均为25℃,最适pH均为7.0;突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍,L-ILe转化率提高了28%。羟基化反应体系的最优转化条件为:20 mmol/L L-ILe,20 mmol/L α-酮戊二酸,8 mmol/L Fe~(2+),30 mmol/L抗坏血酸和HEPES(50 mmol/L,pH 7.0)缓冲液。在最优转化条件下,重组菌E. coli BL21/pET28a-ido~(I156A)进行分批补料转化底物,时间间隔为4 h,32 h后得到77.3 mmol/L 4-HIL,底物最高转化率98.35%。     

基于响应面法优化谷氨酸棒杆菌发酵条件

该研究以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）P169为研究对象,以谷氨酸产量为主要评价指标,采用单因素试验和响应面法对其发酵条件进行优化,并进行摇瓶和20 L罐分批补料发酵验证。结果表明,谷氨酸棒杆菌P169产谷氨酸的最佳发酵条件为酵母粉41.0 g/L、葡萄糖27.0 g/L、尿素12.0 g/L和pH 7.0。在此优化条件下,谷氨酸产量达25.1 g/L,比优化前（16.5 g/L）提高了52.1%。以此为基料进行20 L罐分批补料发酵,谷氨酸产量达155 g/L,比优化前（142 g/L）提高了9.2%。该研究为提高谷氨酸棒杆菌谷氨酸产量提供了一种技术解决方案。     

γ-聚谷氨酸产生菌发酵培养基的响应面法优化研究

利用从纳豆中筛选得到的一株纳豆芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)。在单因素优化实验的基础上,通过响应面法对发酵培养基进行优化,得到最佳培养基配方为蔗糖43.92 g/L、大豆蛋白胨7.00 g/L、谷氨酸钠46.32 g/L,γ-PGA产量由原来的7.253 g/L提高到11.794 g/L。     

响应面法优化枯草芽孢杆菌3-羟基丁酮发酵培养基

采用响应面法对枯草芽孢杆菌TH-55 3-羟基丁酮发酵培养基进行了优化,确定了葡萄糖、酵母浸膏和玉米浆是影响菌株3-羟基丁酮发酵产率的主要因素.优化获得的发酵培养基组成:葡萄糖102g/L,酵母浸提物6.8g/L,玉米浆26.5g/L,硫酸铵5g/L,硫酸锰0.05g/L,硫酸镁0.6g/L,磷酸二氢钾0.5g/L.在此条件下,菌株摇瓶发酵3-羟基丁酮平均产率达到46.25g/L,较优化前的菌株产率35.21g/L相比提高了31％.10L发酵罐发酵试验,发酵周期72h,3-羟基丁酮发酵产率达到47.85g/L.     

基于PB试验和响应面分析法对谷氨酸棒杆菌CN1021发酵培养基优化

通过Plackett-Burman试验,得出糖蜜、玉米浆和豆饼水解液对谷氨酸产量有显著影响,通过最陡爬坡试验和响应面分析法对发酵培养基组成进行优化,得到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)最适发酵培养基组成为葡萄糖30g/L,玉米浆33.9g/L,豆饼水解液19.9g/L,糖蜜30.6g/L,MnSO40.03g/L,FeSO40.03g/L,MgSO42g/L,K2HPO44.5g/L,生物素(VH)0.3mg/L,硫胺素(VB1)0.3mg/L。通过对模型验证实验,谷氨酸产量实际值为111.33g/L,且较未优化的发酵培养基相比谷氨酸产量提高了22.75%。     

响应面法优化普鲁兰多糖发酵培养基

通过对出芽短梗霉生长的培养基进行优化,以提高普鲁兰多糖的产量。首先采用单因素试验筛选出有显著效应的3个因素,再利用响应面Box-Behnken设计优化显著因素的水平。结果表明：碳源(蔗糖)添加量、氮源(酵母浸膏)添加量和金属离子对粗普鲁兰多糖的产量都有显著影响(P＜0.05),蔗糖添加量和酵母浸膏添加量的交互作用相对明显,蔗糖添加量和金属离子以及酵母浸膏添加量和金属离子的交互作用不显著。优化的培养基组成为：蔗糖添加量56.63g/L、酵母浸膏添加量3.74g/L、金属离子选择Mg2+,此条件下粗普鲁兰多糖产量为60.358g/L。     

微生物发酵生产水苏糖培养基的优化

通过Plackett-Burman设计和响应面分析对微生物发酵提纯水苏糖的培养基进行了优化。通过Plackett-Burman设计从6个因素中筛选出了有显著影响的酵母浸膏、酪蛋白胨和硝酸钠3个因素;通过最陡爬坡和Box-bohnken设计进一步优化,并利用Minitab软件进行回归分析,得到以上3个因素的适宜浓度分别为(g/L):酵母膏13.8、酪蛋白胨8.2、硝酸钠4.8。采用优化的培养基下,水苏糖纯度由85%提高到91%。     

响应面法优化莲子黄酒的发酵工艺条件

以大米和莲子为原料,采用响应面试验设计优化莲子黄酒的发酵条件,探索其发酵规律。在单因素试验基础上确定以发酵时间、接种量、发酵温度为影响因素,以酒精体积分数为响应值,根据Box-Behnken中心组合方法采用三因素三水平响应值试验设计优化。结果表明,莲子黄酒最佳发酵工艺条件为:发酵时间14 d、接种量1.0%、发酵温度30℃,酒精体积分数14.2%,与预测值14.54%基本一致。说明该模型能较好地预测莲子黄酒发酵过程中的酒精体积分数。     

响应面法优化牛樟芝高产总三萜发酵培养基

为提高牛樟芝(Antrodia camphorata)菌丝体产三萜类化合物的能力,采用筛选试验(Plackett-Burman,PB)试验和中心组合设计(central composite design,CCD)试验对发酵培养基进行优化。首先通过PB试验对影响菌丝体产三萜类化合物的8个组分进行筛选,确定玉米粉、牛肉膏、黄豆粉为3个主要影响因素,然后依次用最陡爬坡试验、CCD和响应面分析,确定主要因素的最佳浓度。由此得到最佳培养基配方:20 g/L葡萄糖,10 g/L大豆粉,16.07 g/L玉米粉,4.5 g/L牛肉膏,31.93 g/L黄豆粉,1 g/L MgSO4,2 g/L KH2PO4,50 mg/L VB1。采用基本发酵培养基培养牛樟芝其菌丝体中总三萜含量为(12.29±0.43)mg/g,经培养基优化处理后三萜类含量为(15.40±0.15)mg/g,相比初始其产量提高了25.3%。     

响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵条件

在单因素试验的基础上,应用响应面分析法对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的因素进行分析,得到了最佳发酵条件为温度40℃、pH8.04、接种量8.3%、发酵时间56h,此条件下的蛋白酶酶活为247.8U/ml,比单因素试验的最高酶活228.3U/ml提高了8.54%。     

响应面法优化短梗霉多糖培养条件

采用响应面方法对出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)生产短梗霉多糖的培养条件进行了优化。首先利用Plackett-Burman设计法研究了培养条件对响应值的影响程度,发现(NH_4)_2SO_4和K_2HPO_4的质量浓度对多糖产量的影响显著。然后利用最陡爬坡法逼近最大响应区域.最后在上升最高点处由中心组合试验和响应面分析确定其最优培养条件。并通过实验测得优化培养条件后的多糖产量为24.652 g/L,与预测值24.597 g/L非常接近,且比优化前多糖产量提高了28.4%。     

响应面法优化产赤藓糖醇菌株RH-UV-L4-F9的发酵条件

为进一步提高糖蜜玉米浆发酵生产赤藓糖醇的产量,以高产赤藓糖醇耐高渗酵母RH-UV-L4-F9为出发菌株,采用响应面法优化发酵工艺参数。根据Box-Benhnken设计原理,在单因素试验基础上,采用三因素三水平响应面分析,确定最佳发酵工艺参数为：温度32.3℃、pH5.1、摇床转速176r/min。在此优化条件下赤藓糖醇产量达到166.89mg/mL,是初始条件下的1.2倍。     

响应面法优化麦麸发酵产植酸酶条件的研究

以纳豆芽孢杆菌JSU-2为供试菌株,麦麸皮为唯一固体发酵基质,运用响应面法对其产植酸酶的条件进行优化.首先用24-1部分因子试验设计对影响植酸酶活性的主要变量进行了评价,发现主要影响因子为麸皮与水的比例和培养时间.然后用中心组合试验设计确定主要变量的最佳水平.最佳产酶发酵条件为:粒径为3 mm、麸皮与水的比例为1:9.6、接种量为3 mL和培养时间为25 h.在最佳产酶条件下进行发酵,得到的植酸酶活性为595 U/g麦麸.     

利用响应面法优化丙酮酸发酵培养基

采用响应面法对丙酮酸产生菌光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)TP19的发酵培养基进行了优化。用Plackett-Burman方法对影响发酵各因素的效应进行评价,筛选出有显著效应的3个因素:硫酸铵、葡萄糖和烟酸;通过中心组合实验及响应面分析优化了这3个主要因素。采用优化后的条件进行摇瓶发酵,丙酮酸产量为42.4 g/L。进行5L自控发酵罐发酵,丙酮酸产量为44.8g/L,比优化前提高了16.2%。