高产虾青素红法夫酵母菌株的选育和发酵参数优化

目的:选育出高产、稳产虾青素的红法夫酵母菌株,并对培养基进行参数优化。方法:以红法夫酵母(P.Rhodozyma 02)为出发菌株,分别进行紫外-氯化锂(UV-Li Cl)和~(60)Co-γ诱变,从中筛选出高产虾青素的突变株作为基因组重排育种的出发菌株;经过五轮原生质体融合,筛选得到的基因组重排最优菌株。通过富含虾青素合成前体的天然促进剂的添加及对发酵培养基的参数优化,得到最佳培养基条件。结果:最终筛选得到高产、稳产虾青素的融合菌株F5-9,在此基础上优化得到最佳培养基参数条件为葡萄糖30.0 g/L,蛋白胨3.0 g/L,酵母浸出粉7.0 g/L,(NH_4)_2SO_45.0 g/L,Mg SO_4·7H_2O 2.75 g/L,KH_2PO_41.5 g/L,Ca Cl_2·2H_2O 0.2 g/L,胡萝卜汁150 mg/L,最终虾青素的产量高达(83.39±1.03)mg/L,是原始出发菌株的17.56倍。结论:采用传统诱变和基因组重排技术,能显著提高虾青素产量,培养基中添加虾青素前体物质胡萝卜汁能进一步促进虾青素产量的提高。     

复合诱变选育高产虾青素的红法夫酵母菌株

以红法夫酵母野生型菌株(Phaffia rhodozyma 02)为原始出发菌株,依次进行2轮紫外(UV)-氯化锂(LiCl)和60Co-γ射线诱变,以40μmol/L二苯胺为抗性筛选剂,筛选得到1株遗传稳定的高产虾青素红法夫酵母突变菌株H4-4,命名为HSC-125,虾青素产量为25.36 mg/L,是原始出发菌株P.rhodozyma 02(4.75 mg/L)的5.34倍。采用2轮UV-LiCl和60Co-γ射线复合诱变结合二苯胺作为抗性筛选剂,选育得到的高产虾青素的红法夫酵母突变株,其遗传性质稳定,展现良好效果。     

MPMS诱变结合抗生素抗性选育多杀菌素高产菌株

采用多功能等离子体诱变系统(MPMS)对菌株ASAGF 13-8-1进行诱变,并通过链霉素、庆大霉素、利福平、氯霉素四种抗生素抗性筛选多杀菌素高产菌株。利用96孔板发酵培养结合生物检测的快速方法进行高产菌株高通量初筛,摇瓶发酵进行复筛。通过5轮复筛验证,获得1株产量较出发菌株提高28.68%且遗传稳定的突变菌14-2。比较MPMS诱变和MPMS诱变结合0.9μg/mL链霉素、14μg/mL庆大霉素、400μg/mL利福平、2μg/mL氯霉素的四重抗性筛选对出发菌株ASAGF 13-8-1的作用效果,结果显示MPMS诱变结合抗生素抗性筛选更有利于多杀菌素高产菌株的选育。     

传统诱变与基因组重排技术相结合选育耐高温酿酒酵母菌株

以酿酒酵母AY12为出发菌株,采用传统人工诱变育种与基因组重排技术相结合的方法选育出耐高温且高产乙醇的酿酒酵母菌株.通过将出发菌株进行紫外诱变,获得酿酒酵母突变群体,并从中筛选出耐高温且高产乙醇的23株突变株作为正向突变文库;将该文库通过酵母高效产孢与杂交反应实现突变文库的全基因组重排,筛选得到的基因组重排最优菌LYQ-F1的高温耐受性较出发菌株AY12明显提高,且在高温模拟发酵工艺中其乙醇产量较出发菌株提高了22.1％.     

高产细菌素植物乳杆菌的诱变选育研究

为获得细菌素高产菌株,以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9为出发菌株,对其进行亚硝基胍(NTG)诱变、常压室温等离子体(ARTP)诱变,以及基因组改组。结果表明,亚硝基胍诱变的最佳浓度为4 mg/m L,经筛选得到两株突变株N4-26、N4-27,其抑菌效价分别为2531.93、3057.32 IU/m L;常压室温等离子体诱变最佳时间为10 s,经筛选得到两株突变株ARTP10-37、ARTP10-61,其抑菌效价分别为2974.27、3261.62 IU/m L。将上述抑菌效价提高的菌株经四轮基因组改组后,得到一株突变株F4-2,其抑菌效价达到7374.76 IU/m L,相对于原始菌株提高了2.35倍,且遗传稳定性良好。研究表明理化诱变结合基因组改组的方式是快速获得理想菌株的有效方法。     

高产类胡萝卜素酵母菌的诱变选育

从12株红酵母菌中筛选得到一株生物量和类胡萝卜素产量较高的菌株KC 8,以KC 8为出发菌株,依次经ARTP诱变、亚硝酸钠诱变、紫外诱变、紫外-亚硝酸钠复合诱变,再进行一轮ARTP诱变。测得KC 8类胡萝卜素产量为8.67 mg/L,26 S r DNA测序表明,该菌株与胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)100%相似性;最终从1 000株诱变存活菌株中筛选得到高产类胡萝卜素突变菌株K 4,产量为15.14 mg/L,为出发菌株的1.75倍,经高效液相色谱(HPLC)分析表明该菌株所产类胡萝卜素的主要成分为β-胡萝卜素。     

纳他霉素高产突变菌株高通量筛选方法的建立

为了提高纳他霉素（natamycin）高产菌株诱变后的筛选效率,建立一种24孔深孔板/酶标仪发酵初筛和摇瓶发酵复筛的高通量筛选检测方法,得到在24孔深孔板发酵结果与摇瓶发酵有很好的一致性,证实了酶标仪检测可以替代高效液相色谱法检测用于突变菌株的快速高通量筛选。以褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus TUST01）作为出发菌株,通过多轮的紫外诱变、常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）以及硫酸二乙酯复合诱变、孔板初筛与摇瓶复筛,从887株突变株中筛选出遗传性稳定的高产菌株S. gilvosporeus Y-4-75,其摇瓶纳他霉素产量（5.95 g/L）与生物量（29.19 g/L）较出发菌株分别提高了31.93%和15.19%。     

改良Genomeshuffling技术选育埃博霉素B高产菌株

目的：用改genomeshuffling技术选育埃博霉素高产菌株。方法：本研究对genomeshu御ing技术进行了改良,具体是在递归原生质体融合过程中对原生质体进行了紫外诱变;通过UV和DES复合诱变方法获得T4株出发菌株,并用改良genomeshuffling技术选育埃博霉素B高产菌株。结果：通过三轮基因组重组成功选育到了2株遗传稳定的高产埃博霉素B重组菌株,其中一株重组菌株S0073-45的埃博霉素B产量达到T42．5mg／L。结论：该研究证明改良后的基因组重组技术不仅能有效提高埃博霉素B的产量,而且比传统的基因组重组技术更为高效。     

利用全基因组改组技术提高SubtilosinA的产量

以Bacillus subtilis nja A1B2-2为出发菌株,在最佳的原生质体形成、再生和融合条件的基础上,将前期经过理化诱变筛选的四株高产菌株进行两轮基因组改组。结果表明,当以0.6mol/L Na Cl为高渗洗涤液,0.1mg/m L溶菌酶酶解40min后,涂布在以SMM为高渗体系的NB再生培养基上,原生质体形成率达到95.49%,再生率为89.25%。优化原生质体的融合条件,融合率达到了1.39×10-3。在此基础上将四株高产Subtilosin A菌株进行两轮全基因组改组,结合双亲灭活的筛选方法,挑选出一株遗传性状稳定的高产菌株R2-264,产量达17.59mg/L,比出发菌株提高了3.58倍。     

常压室温等离子诱变与微生物微滴培养选育几丁质脱乙酰基酶高产菌株

该研究将室温等离子（ARTP）诱变与微生物微滴培养（MMC）技术应用于几丁质脱乙酰基酶（CDA）高产菌株的诱变选育,构建高产CDA菌株的诱变及高通量筛选方法。结果表明,经过4轮的ARTP诱变及MMC筛选,从200个不同的液滴中共筛选出5个发酵产酶明显提升的液滴,并通过进一步的平板筛选、24-深孔板复筛,获得了17株产酶提高300%以上的诱变菌株。通过对比分析17株高产菌株产CDA的能力,确定了1株最佳CDA高产菌株B4,其CDA最大产量比出发菌株提高了3.15倍,发酵产酶总量达到419.11 U/mL,为原始菌种的3.90倍。该研究为CDA高产菌株的诱变选育及高通量筛选提供了借鉴。