膜醭毕赤酵母结合杀菌剂对柑橘果实采后病害的控制效果

探究膜醭毕赤酵母与低剂量杀菌剂（多菌灵、甲基硫菌灵）结合使用对柑橘采后病害的防治效果。通过筛选能与膜醭毕赤酵母结合使用的杀菌剂,考察柑橘常见病原菌对杀菌剂的敏感性,继而在果实上验证结合处理对柑橘采后病害的防治效果。离体实验的结果表明,多菌灵和甲基硫菌灵对酵母生长无抑制作用;柑橘青霉菌、绿霉菌和炭疽菌对两种杀菌剂敏感性不同,但半数抑制浓度（EC50值）均小于建议剂量的1%。果实活体实验的研究结果表明,膜醭毕赤酵母结合低剂量的多菌灵或甲基硫菌灵对柑橘果实青霉病、绿霉病的防治效果均好于膜醭毕赤酵母和低剂量杀菌剂单独处理;但膜醭毕赤酵母结合低剂量的甲基硫菌灵对夏橙果实接种炭疽病的防治效果不佳。同时,膜醭毕赤酵母结合低剂量的多菌灵或甲基硫菌灵对夏橙果实自然发病率的控制呈增效作用,对锦橙果实自然发病率的控制呈叠加作用,两种结合处理均能保证夏橙和锦橙的好果率。     

膜醭毕赤酵母挥发性物质对灰葡萄孢菌的抑菌活性及组分分析

为探究膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)对采后灰葡萄孢菌的抑菌机制,该研究对其挥发性物质进行了抑菌活性与抑菌机制分析。结果表明,灰葡萄孢菌被挥发性物质熏蒸48 h时,菌丝长势明显受阻,抑制率高达72.41%,其产孢量始终低于空白组(P<0.05)。经熏蒸后72 h,菌丝体细胞膜内核酸、蛋白质的大量外泄(P<0.05)改变了细胞膜的通透性,同时,通过扫描电镜观察到处理过的菌丝表面出现干瘪、皱缩甚至部分菌丝胞内的内容物渗漏。有伤接种实验证明熏蒸处理的番茄果实病斑直径仅为(1.47±0.16) cm,显著低于空白对照组。利用顶空固相微萃取-气质联用法(headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)分离鉴定到20种挥发性物质,主要组分为醇类(39.26%)、酮类(24.72%)和有机酸类物质(8.51%)。上述结果为研究酵母菌防控采后果蔬腐烂提供了理论依据,为生防菌的安全防腐策略提供新思路。     

膜醭毕赤酵母和壳聚糖复合处理对柑橘果实炭疽病的诱导抗病性

以‘锦橙447’为试材,研究了膜醭毕赤酵母和壳聚糖复合处理对柑橘果实采后炭疽病的防治效果,以及在接种炭疽菌的情况下诱导柑橘果实抗病性的机制。结果表明：1×108 cells/mL的膜醭毕赤酵母和0.1 g/L的壳聚糖单独处理均能够有效抑制柑橘果实炭疽病的发病率,而复合处理的防治效果更好。膜醭毕赤酵母和壳聚糖复合处理能够增加NO、水杨酸、H2O2等信号物质的含量;提高苯丙烷代谢中间产物阿魏酸、对香豆酸、绿原酸的含量,相关防御酶如苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟基化酶、4-香豆酸:辅酶A连接酶、过氧化物酶、多酚氧化酶的活力;以及病程相关蛋白如几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活力。该研究结果表明,膜醭毕赤酵母与壳聚糖复合处理可通过增强柑橘的抗病性来提高柑橘炭疽病的防治效果。     

膜醭毕赤酵母对杨梅果实采后绿霉病的抑制与抗病性的诱导

为研究膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)对杨梅果实绿霉病的抑制及其对抗病性的诱导作用,将杨梅果实先接种15μL浓度为1×109cfu/mL的膜醭毕赤酵母菌悬液,风干1h后再接种15μL的1×105cfu/mL的桔青霉(Penicillium citrinum)孢子悬浮液,然后转入(1±1)℃下贮藏8d,每隔2d测定果实腐烂率、病斑直径、抗病相关酶几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性以及总酚含量;同时分析了离体条件下P.membranaefaciens对P.citrinum孢子萌发和芽管伸长的影响。结果显示,P.membranaefaciens可显著抑制果实贮藏期间绿霉病的发生,并可诱导几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、PAL、POD和PPO活性和总酚含量的升高;同时P.membranaefaciens在离体条件下也明显抑制病原菌的生长。因此,P.membranaefaciens抑制杨梅果实采后腐烂与直接抑制病原菌生长以及间接诱导抗病性密切相关。     

茉莉酸甲酯提高膜醭毕赤酵母对杨梅果实采后绿霉病生防效力的研究

研究了茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)复合膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)处理对"乌种"杨梅果实由桔青霉(Penicillium citrinum)引起的绿霉病的抑制效果,同时分析了MeJA对酵母菌和病原菌生长以及果实抗病性的影响。结果显示:MeJA可有效提升P.membranefacien生防效力,10μmol/L MeJA与1×109CFU/mL P.membranefacien菌悬液的复合处理比单一处理能更有效抑制杨梅果实绿霉病的发生;该复合处理也更为显著的诱导了杨梅果实抗病相关酶活性的上升;此外,MeJA还可直接提高P.membranaefaciens在NYDB培养基和杨梅果实伤口处的数量,但MeJA对病原菌P.citrinum生长无抑制效果。这些结果表明,MeJA主要是通过直接促进拮抗酵母生长以及间接诱导果实抗病性来提升P.membranaefaciens生防效力,从而起到有效抑制杨梅果实采后腐烂的作用。     

膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液的抑菌机制与初步应用

该研究制备一种含108 CFU/mL 膜醭毕赤酵母KD-316-3（Pichia membranaefaciens KD-316-3）的海藻糖基复合保鲜液,以果实黑斑病菌链格孢霉菌（Alternaria species）为对象进行离体抑菌研究,并进行复合保鲜液的冬枣应用保鲜试验,用以探究复合保鲜液的抑菌机制和应用效果。试验结果表明,在离体条件下,复合保鲜液处理能抑制病原链格孢霉菌的生长,拮抗效率26.48%,使病原菌菌丝生长畸形,电解质外渗,菌丝体核酸泄漏,胞内可溶性蛋白含量降低;在冬枣贮藏过程中,复合保鲜液能抑制冬枣果实失重率的上升,有效减缓冬枣果实的病斑腐烂,对果实丙二醛含量及多酚氧化酶活性也产生明显影响,提高过氧化物酶活性。综合分析,使用膜醭毕赤酵母KD-316-3 复合保鲜液处理冬枣果实可抑制病原菌引起的腐烂,维持果实良好品质。     

膜醭毕赤氏酵母在葡萄汁发酵期间的生长与存活

叙述了５个膜醭毕氏赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）和啤酒酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｎｙｃｅｓＣｅｒｅｖｉｓｉａｅ）同时接种于葡萄汁中，在１０℃，２０℃下它们的生长与存活，研究了最初的溶解氧和接种量对其生长与存活的影响。４个菌种在发酵初期显示了一定的生长能力，直到发酵结束仍以１０＾２－１０＾３ＣＦＵ／ｍＬ的浓度存活下来，最初细胞量大，发酵温度低能促进膜醭毕赤氏酵母的生长与存活。     

卡利比克毕赤酵母活细胞制剂加工工艺的研究

分别对卡利比克毕赤酵母的活细胞液体和固体剂型产品的加工工艺进行研究。利用磷酸缓冲溶液添加0.01%维生素C和2.5%海藻糖制备的卡利比克毕赤酵母液体制剂在20℃保藏15d仍然保持81.8%存活率。利用微波真空干燥技术在真空度8kPa,功率先为200W,后为100W,然后再进行真空干燥,得到含水量9.4%,活细胞率为100%的活性干酵母,经过4℃保藏3个月仍然保持84.8%存活率。无论采用液体制剂还是固体制剂,在保藏后对水果的病害仍具有良好的生物防治效果。      

卡利比克毕赤酵母活细胞制剂加工工艺的研究

分别对卡利比克毕赤酵母的活细胞液体和固体剂型产品的加工工艺进行研究。利用磷酸缓冲溶液添加0.01%维生素C和2.5%海藻糖制备的卡利比克毕赤酵母液体制剂在20℃保藏15d仍然保持81.8%存活率。利用微波真空干燥技术在真空度8kPa,功率先为200W,后为100W,然后再进行真空干燥,得到含水量9.4%,活细胞率为100%的活性干酵母,经过4℃保藏3个月仍然保持84.8%存活率。无论采用液体制剂还是固体制剂,在保藏后对水果的病害仍具有良好的生物防治效果。     

襄阳大头菜腌制液中产膜醭酵母菌的多样性分析

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）研究了襄阳大头菜发酵过程中正常腌制液和长膜醭腌制液中酵母的多样性,同时利用纯培养技术对襄阳大头菜膜醭中的酵母进行了分离和鉴定。PCR-DGGE结果显示,在襄阳大头菜不同发酵状态腌制液中酵母的多样性没有差异,均为鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和汉逊德巴利酵母（Debaryomyces prosopidis）,但是在长膜醭大头菜腌制液中鲁氏酵母和汉逊德巴利酵母的生物量显著增加。从襄阳大头菜上的膜醭中分离出的酵母与DGGE结果一致。根据以上结果推断,鲁氏酵母和汉逊德巴利酵母存在于不同发酵状态的大头菜腌制液中,但是生物量不同,其的大量生长可能是引起膜醭出现的原因。     

Ion channel activity by Pichia membranifaciens killer toxin

The cytocidal effect of Pichia membranifaciens killer toxin on Candida boidinii cells was studied. The halotolerant yeast P. membranifaciens CYC 1106 produces a unique 18 kDa killer toxin that exerts its killer activity against C. boidinii IGC 3430 only in the presence of NaCl. Metabolic events associated with the loss of C. boidinii IGC 3430 viability were quantitatively identical to those known to occur with K1 killer toxin-treated sensitive strains of Saccharomyces cerevisiae. The death of sensitive cells was characterized by a leakage of potassium, an influx of sodium and a decrease in intracellular pH. These effects occurred prior to and concomitantly with cell death, indicating that they were primary effects of the action of the toxin. Here we report that this protein forms ion-permeable channels in liposome membranes. These channels are freely permeable to common physiological ions. We suggest that channel formation is the cytotoxic mechanism of action of P. membranifaciens killer toxin. The channels described here are sufficiently non-selective to mediate cell death through a discharge of cellular membrane potential and changes in ionic homeostasis. No specific effects against killer toxin-treated sensitive cells were observed when the cell cycle was analysed.     

发动机燃烧室内壁材料热环境的气动热试验模拟技术研究

利用超声速矩形湍流导管和等离子电弧加热器模拟了发动机燃烧室内流和高超声速飞行器外壁面外流热环境,进行了平板表面冷壁热流测量和燃烧室内壁材料考核试验。结果表明:由于辐射换热的影响,在选取的两个典型来流条件下,发动机燃烧室内流热环境下的冷壁热流比外流热环境下的高出21%和40%,但是冷壁热流的增量基本相当,约为0.70~0.80MW/m²。随着冷壁热流的增加,辐射换热产生的热流增量的影响力会逐渐减小。材料考核时,相同配方的C/SiC复合材料在内流热环境下的表面温度高出约400℃,背面温度高出约90℃,这种差异对于发动机燃烧室内壁面材料考核至关重要,必须在材料考核试验中加以考虑。      

冰酒中的毕赤属和汉逊属酵母菌的筛选及其在葡萄酒酿造中的应用

从冰葡萄酒自然发酵过程中分离、鉴定出10株毕赤属(Pichia)和汉逊属(Hanseniaspora)酵母,对其耐受性(酒精、糖、酸、SO2)进行研究,筛选得到4株耐受性能优良的酵母菌株,编号为"HO"和"HU"(Hanseniaspora属)、"PO"和"PK"(Pichia属).再将此4个酵母菌株与商业酿酒酵母(S...     

川西高原冰酒发酵中Pichia anomala的鉴定与耐受性研究

从四川藏区高原威代尔冰葡萄酒发酵过程中分离纯化出了异常毕赤酵母(Pichia anomala)菌株,采用18S rDNA D1/D2序列进行了基因鉴定,并对其耐受性进行了研究.结果表明,该酵母菌分别在28℃、pH=4.0或6.0条件下,生长情况较好,具有一定的抗低温性能.随着乙醇、二氧化硫和蔗糖含量的增加,该酵母菌的生长情况受到一定的抑制,该酵母菌对乙醇、二氧化硫和糖均有一定的耐受性.     

甲醇毕赤酵母Pichia methanolica的高效电转化方法

采用电穿孔的方法对甲醇毕赤酵母进行外源DNA的转化。通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pMETA-Lip对甲醇毕赤酵母PMAD16的高效电转化方法。结果表明,当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、质粒DNA浓度为30μg/mL、采用0.2cm电转杯、电压为600 V时,转化率达到最大值,为57个转化子/μg质粒DNA。经抽样鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。为外源基因在甲醇毕赤酵母中的表达奠定了基础。     

克罗诺杆菌在婴儿配方奶粉及其加工环境中耐受性和耐药性研究进展

克罗诺杆菌（Cronobacter）是一种食源性致病菌,容易感染新生儿和低体重早产儿并引起坏死性小肠结肠炎、脑膜炎和败血症等疾病,致死率高达40%~80%,治愈后可能存在严重精神系统后遗症。由流行病学可知,婴幼儿感染克罗诺杆菌与婴儿配方奶粉（Powdered Infant Formula,PIF）的关系十分密切。近年来,克罗诺杆菌污染PIF事件频发并且因其耐药性给临床治疗带来巨大挑战,造成严重后果。究其原因,是由于该菌对PIF及其加工环境的耐受能力强,不易被完全消杀从而造成持续污染。因此,为详细了解克罗诺杆菌在不利条件下的生长特性,该研究从克罗诺杆菌耐热性、耐干燥性、耐酸碱性、耐紫外性以及耐药性多个角度综述目前克罗诺杆菌耐受性相关研究进展,以期为我国克罗诺杆菌的防控消杀以及临床治疗提供参考。     

4株乳酸菌对模拟胃肠环境的耐受性及生长特性研究

对4株来源于自然发酵肉制品中的乳酸菌进行耐酸耐胆盐性能的测定,选取在pH3.0和含0.3 g/100 mL胆盐的MRS培养基中存活率均超过50%的2株菌（M12、M23）,进一步研究其在模拟胃肠液中的耐受性及MRS培养基中的生长特性。结果表明,这2株乳酸菌对人工模拟胃肠道环境有较好的耐受性,经过人工模拟胃液处理2 h后,存活率均＞50%,经人工模拟肠液处理10 h后仍可存活;这2株菌具有较强的增殖及产酸能力,24 h内均已进入稳定生长期,随着菌体数目的增加,培养基pH值快速降低,在肉制品的发酵温度范围内均能较好地生长。因此,这2株菌可作为潜在的益生菌菌株应用于肉制品的发酵。     

Production of volatile phenols by Pichia manshurica and Pichia membranifaciens isolated from spoiled wines and cellar environment in Patagonia

In order to detect spoilage yeast species in wines showing off-odors, different yeast isolation protocols were evaluated. Independently of the isolation method, only Saccharomyces cerevisiae and Pichia manshurica were detected. The spoilage capacity of P. manshurica regional isolates was evaluated in red wine and the production of volatile phenols was evidenced. To evaluate the possible source of contamination, yeasts from both grapes and cellar surfaces were obtained. Hanseniaspora uvarum and Zygoascus hellenicus were detected in both sound and damaged grapes from sunny areas. The most frequent species in cellar surfaces was Candida boidinii, Pichia membranifaciens and P. manshurica were detected in filters. The intra-specific genetic characterization of the P. manshurica isolates by mtDNA-RFLP demonstrated that the same strain was detected in both wine and filter. Most P. membranifaciens isolates produced 4-EP (maximum level of 1.895 mg/L) and particularly high levels of 4-EG (maximum level of 10.260 mg/L) were produced by P. manshurica isolates in synthetic wine-like medium. In this work the capacity of P. manshurica and P. membranifaciens species to produce volatile phenols was shown for the first time.     

海藻糖合酶基因在毕赤酵母中的表达

首次构建来源于恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因（AE015451.1）的真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达。PCR扩增目的基因,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的pPICZaA中,经PCR检测和序列测定准确后,通过电击法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,利用含Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,提取阳性转化子基因组并利用特异性引物PCR得到一条与目的基因大小相同的条带,说明目的基因转入成功,诱导重组蛋白表达并用SDS-PAGE检测可见一条约76 ku与目的蛋白大小预测相符合的蛋白条带,最后HPLC检测重组蛋白可将麦芽糖特异转化为海藻糖,说明外源表达的海藻糖合酶具有一定酶活。通过PCR、SDS-PAGE和HPLC结果说明成功构建重组pPICZaA-TreS质粒并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,且海藻糖合酶基因得到预期的表达并具有活性,为下一步研究奠定基础。