两种强启动子在枯草芽孢杆菌中调控表达研究

通过玉米赤霉烯酮(ZEN)降解酶基因ZLHY6的表达水平及降解酶的活性评价,比较了两种组成型强启动子P43与Plap S调控异源基因表达的效果。结果表明,在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs 168中,Plap S调控的降解酶基因得到了高效表达,在发酵12 h时降解酶活性达到最高值,酶活为219.02 U/m L。由启动子Plap S介导的ZEN降解酶基因表达载体p WBZ7可以在Bs 168中稳定遗传,为降解酶的高效分泌表达奠定了基础。     

海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为表达平台,海藻糖合酶为表达蛋白,研究了单启动子和多个启动子串联对外源蛋白表达的影响。分别选择6个启动子构建P_(srfA)、P_(43)单启动子和P_(abrB-spoVG-LytR-mmgA)四个时期特异性启动子串联表达系统进行验证。根据实验结果分析,组成型启动子P_(43)转录强度最高,摇瓶中酶活达到3 381 U/g,串联启动子P_(abrB-spoVG-LytR-mmgA)强度次之。针对验证酶活最高的重组菌pHT01-P_(43)-treS进行发酵优化,并在5 L发酵罐中进行放大实验,酶活达到7 215 U/g。实现了海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中自诱导高效表达,为获得高效率制备海藻糖合成酶的表达系统奠定了基础。     

半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件

从嗜热脂肪芽孢杆菌 (IAM 110 0 1)中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB ,构建具T7强启动子的pET 2 0 (b) bgaB质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 .经IPTG诱导后 ,重组菌周质中乳糖酶酶活达到 0 .12U /mL ,胞内酶活为 1.35U /mL ,比酶活为 6 .6 6U/mg蛋白 ,比酶源菌产生的酶活提高 5 0倍 .通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究 ,重组菌产生的比酶活进一步提高至酶源菌的 90倍 .     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其发酵条件优化

以枯草芽孢杆菌为表达系统,以中温α-淀粉酶为目标蛋白,研究了启动子和信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。分别选取了4种启动子以及8种信号肽来进行筛选,结果表明,启动子PApr E的强度最高,信号肽SPnpr E的分泌效率最好。针对重组菌株1A751Q31进行系统的发酵优化,在72 h发酵液中α-淀粉酶酶活达到380U/m L。在7.5 L发酵罐中进行放大实验,发酵液中α-淀粉酶酶活最高达到853 U/m L。以上研究表明,α-淀粉酶适合在枯草芽孢杆菌中进行表达,同时表明枯草芽孢杆菌是良好的异源蛋白表达系统。     

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。     

一种耐酸热普鲁兰酶生产菌种的分子构建及发酵研究

将长野芽胞杆菌的普鲁兰酶基因经密码子优化后,组建了人工合成的二联启动子Pga2,并将它克隆到枯草芽胞杆菌穿梭质粒p MK4-BPB以及自杀质粒p GE-BPB中;经转化和筛选获得了中性蛋白酶基因npr E被敲除的普鲁兰酶生产菌株CH-1;该重组菌在基础培养基中所产普鲁兰酶的酶活达到30.3 U/m L;经过对培养基组分及发酵条件(培养温度、起始p H,起始接种量等)进行优化,确定了发酵的最适碳源为45 g/L的蔗糖,氮源为60 g/L的麸皮+豆粕时,设定初始培养基的p H为6.2,在培养温度为32℃时进行发酵,CH-1发酵产重组普鲁兰酶酶活高达268 U/m L。     

重组蔗糖异构酶在短短芽孢杆菌中的表达及发酵优化

对重组菌株Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI摇瓶发酵产蔗糖异构酶进行研究,进一步探讨了3 L发酵罐不同发酵条件对菌体生长及产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵后胞外酶活为50 U/mL,最优3 L发酵罐培养条件为:初始碳源为葡萄糖质量浓度10 g/L,初始氮源为多聚蛋白胨、牛肉浸膏质量浓度各15 g/L,发酵温度30℃,溶氧30%,在此条件下得到的最高酶活为275 U/mL。为了探索启动子对蔗糖异构酶表达的影响,分别选取来源于枯草芽孢杆菌的启动子Papr-E,Pnpr-E,Pamy以及来源于巨大芽孢杆菌的启动子Pxyl进行研究。结果表明,使用启动子Papr-E的表达量最高。进一步优化摇瓶发酵条件,重组菌株BCpNapr-SI摇瓶发酵的胞外上清酶活为137 U/mL,在此条件下进行3 L发酵罐发酵,最终发酵上清胞外酶活为485.5 U/mL,是未优化启动子的1.76倍。     

山西老陈醋中芽孢杆菌的RAPD分型及其与性状之间的关系

从山西老陈醋醋酸发酵过程的醋醅中分离芽孢杆菌(Bacillus),采用分子生物学技术对其进行鉴定,并研究菌株随机扩增多态性脱氧核糖核酸(RAPD)分型和产酶、乙偶姻、多酚、总酯之间的关系,从中筛选一株优良菌株。结果表明,共分离出30株芽孢杆菌,其中11株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、8株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、6株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、2株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、1株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)。芽孢杆菌种内具有基因多样性,同种同型别的芽孢杆菌性状具有相似性;但同种不同型别的芽孢杆菌特性具有差异性。最终筛选出1株产糖化酶(89.68 U/m L)、蛋白酶(34.53 U/m L)、乙偶姻(1.05 mg/m L)、多酚(401.36μg/m L)、总酯(9.62 g/100 m L)能力均较强的解淀粉芽孢杆菌38。     

多序列比对在克隆表达一株未知芽孢杆菌角蛋白酶基因中的应用

为克隆表达一株未知芽孢杆菌的角蛋白酶基因,本文对芽孢杆菌属来源的13个角蛋白酶基因进行了分类比对,并设计简并引物,成功筛选出一株未知芽孢杆菌的角蛋白酶基因,在大肠杆菌中克隆表达,最后通过SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)分析和酶活测定验证表达成功,同时还确立重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)的最佳诱导温度为20℃,经过0.5 mmol/L IPTG (isopropylthio-galactoside)诱导16 h后,粗酶液中的角蛋白酶酶活达到389.7 U/mL。本文证明了通过多序列比对而设计的角蛋白酶简并引物的有效性,且该方法能够简化角蛋白酶的研究和开发。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。