定点突变提高碱性果胶酶热稳定性

碱性果胶酶(PGL,E.C.4.2.2.2)是一种重要的工业酶,在碱性条件下催化聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解,广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。为提高酶热稳定性,将Bacillus sp.WSHB04-02 PGL与3种耐热酶进行氨基酸序列比对,确定7个在耐热酶中保守但在PGL中不保守的位点(158、N189、G191、S229、K314、S315和I325)作为改造的目标位点,单独突变为耐热酶中的保守氨基酸。酶学性质分析显示,PGL突变体热稳定性均有提高。与野生酶相比,N189E、S229K和I325F的55℃半衰期分别提高2.32倍、2.11倍和1.89倍;I58V和K314M 55℃半衰期分别提高19.4%和38.9%,比酶活分别提高65%和91%。结构分析显示,除S315G外的PGL突变体的分子内的多种作用力数量均发生改变。上述结果表明,定点突变能有效提高PGL热稳定性,分子间作用力的变化可能是酶学性质变化的重要原因之一。     

饱和突变提高肌酸酶热稳定性

为提高肌酸酶(Creatinase,EC 3.5.3.3,CRE)的热稳定性,通过序列比对的方法确定了Arthrobacter nicotianae 23710 CRE热稳定性相关位点K195,并对其进行饱和突变。与野生酶相比,突变体K195V、K195T、K195C和K195L在50℃下的半衰期分别提高260%、 230%、60%和20%;其中,K195V和K195C比酶活分别提高80.7%和88.2%,其他突变体比酶活无明显变化;突变体K195V、K195T、K195C和K195L的催化效率(k_(cat)/K_m)分别提高131%、 218%、 83%和100%。结构分析发现,突变体K195V、 K195T、 K195L较野生酶分别增加了7、12和13个氢键。结果表明:对Lys195的突变可有效改变CRE的热稳定性及催化效率,且分子内部氢键的增加可能是CRE热稳定性提高的重要原因之一。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶G377定点突变及酶学性质表征

采用饱和定点突变和高通量筛选技术,对北京棒杆菌天冬氨酸激酶（aspartate kinase,AK）AK Gly377位点进行突变,并筛选获得高活力突变体G377F,分离纯化后对G377F AK酶学性质进行表征。结果表明：突变体AK最适pH值为9.0,较突变前野生型（wide type,WT）最适pH值为8.5有所提高;最适反应温度与WT一致,均为25 ℃;半衰期由WT的2.6 h提高到5.3 h;pH耐受性在5 h内保持其活力50%以上,与WT 3 h内酶活力保持能力相同。G377F对金属离子和有机溶剂均表现出良好的抗性。其中,Lys的抑制作用在一定程度上被解除,当Lys和Met同时存在时对AK具有明显的激活作用。动力学研究显示：G377F AK Vmax较WT提高9.3 倍;n值为1.0明显低于WT的2.7,说明AK正协同性降低,趋向于米氏酶。     

采用饱和突变提高谷氨酰胺酶的热稳定性

为提高谷氨酰胺酶(glutaminase,EC 3. 5. 1. 2)的热稳定性,利用Discovery studio 2017对Bacillus subtilis谷氨酰胺酶(YbgJ)中具有不利相互作用的49个氨基酸进行虚拟突变,确定了影响酶热稳定性的关键氨基酸位点E3、E55、D213。对上述3个位点分别进行饱和突变,筛选得到55℃半衰期(t_(1/2))较野生酶分别提高58%、69%和41%的突变体E3C、E55F和D213T。构建复合突变体E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T,其t_(1/2)分别较野生酶提高1.73、1.44、1.22和0.97倍。其中,E3C/E55F比酶活较野生酶提高23%,达到693 U/mg。作用力分析发现,突变体E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T分别较野生酶增加30、23、11和8个氢键及减少5、4、4和3个不利相互作用。上述结果表明,酶分子内部关键氨基酸的替换对YbgJ热稳定性有较大的影响,且分子内部不利相互作用的减少和氢键的增加可能是YbgJ热稳定性提高的重要原因。     

理性设计定点突变提高Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶热稳定性

利用SWISS-MODEL在线服务器以栗色浑圆链霉菌(Streptomyces castaneoglobisporus)酪氨酸酶(PDB登录号:2AHL)为模板对S.kathirae酪氨酸酶的3-D结构进行同源模拟。使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)来辅助设计提高酪氨酸酶的稳定性,利用定点突变构建突变体,并且在大肠杆菌中对野生型酪氨酸酶及突变体进行表达,最终获得了两个热稳定性提高的突变体R95Y、G123W。在此基础上进行复合突变,获得了一个热稳定性显著提高的突变体R95Y/G123W。该突变体在60℃的半衰期提高了2.43倍,最适反应温度由45℃提高到50℃,本研究所用的基于蛋白质结构的理性设计提高稳定性的策略也可以应用于其他工业酶类,显示了良好的应用前景。     

基于理性设计提高假交替单胞菌κ-卡拉胶酶热稳定性

对假交替单胞菌JMUZ2的κ-卡拉胶酶进行理性设计,以获得热稳定性提高的突变酶。用PoPMuSiC在线分析工具对假交替单胞菌κ-卡拉胶酶进行分析,筛选了10 个单点突变体。利用定点突变获得突变酶基因,并对突变酶进行诱导表达、纯化及性质鉴定,筛选出酶比活力不降低且热稳定性提高的突变体K155A。热稳定性分析表明,在50、55 ℃和60 ℃分别处理40 min,突变酶残余酶活力分别是野生型酶的1.8、2.7 倍和4.5 倍。酶的结构及分子动力学模拟分析表明,酶分子疏水相互作用和结构刚性的增强是K155A突变体热稳定性提高的可能原因。通过理性设计获得假交替单胞菌κ-卡拉胶酶热稳定性提高的突变体K155A,对改善酶的性质、扩大κ-卡拉胶酶的应用范围以及κ-卡拉胶酶结构与功能关系研究具有重要意义。     

定点突变提高极端嗜热α-淀粉酶ApkA的高温活性和热稳定性

极端嗜热α-淀粉酶具有优良的高温活性和热稳定性,因此在淀粉液化工艺中具有巨大的应用潜力,并且其高温适应性机制研究可以为构建耐高温α-淀粉酶提供理论依据和设计思路。通过分析来源于极端嗜热古生菌Thermococcus kodakarensis KOD1的α-淀粉酶Apk A的氨基酸序列,构建缺失信号肽突变体ApkAds和单点突变体ApkAdsA180K。酶学性质分析表明,与ApkAds相比,突变体ApkAdsA180K的高温活性和热稳定性明显提高。其中ApkAds的最适反应温度为90℃,对应的酶比活力为2 946.75 U/mg;突变体ApkAdsA180K的最适反应温度为100℃,对应的酶比活力为4 501.08 U/mg。ApkAds于90℃的半衰期约为5 h,突变体ApkAdsA180K于90℃的半衰期约为7 h。通过同源模建得到的蛋白质三级结构显示,突变体ApkAdsA180K中氨基酸残基K180与D212间形成离子键。本研究结果表明ApkAdsA180K中K180与D212间离子键有利于其维持其高温活性和热稳定性。     

定点突变技术提高内切葡聚糖酶基因F-10酶活性

利用高酶活F-10突变株内切葡聚糖酶基因进行定点突变,对91位(K91E)和369位(K369R)氨基酸进行突变,构建突变质粒(K91E);(K369R)和(K91E/K369R),转化大肠杆菌BL21,经筛选获得突变内切葡聚糖酶基因工程菌株K91E,K369R和K91E/K369R。经IPTG诱导后,分离纯化酶学性质分析。结果表明:蛋白质相对分子质量为53 000;突变前后最适pH值未发生变化,为pH 6.8;突变体K369R和K91E/K369R的最适温度为50℃,而突变体K91E最适温度发生了很大的变化,为40℃;酶的比活力分别为202、162.8、77.9 U/mg,分别是原始酶(66U/mg)的3.0倍,2.4倍和1.2倍;三个突变酶的热稳定性有较大提高,70℃处理1 h后,原始酶的活性急剧下降,剩余活力为12%,而K91E的剩余活力为36%,K369R剩余活力为30%,K91E/K369R剩余活力为41%。当经80℃处理1 h后,K91E残余活力仍有22%。本研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能及应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。     

定点突变提高过氧化氢酶热稳定性和催化效率

过氧化氢酶催化过氧化氢分解形成水和氧,主要作用是保护细胞免受活性氧(ROS)的损伤,尽管其在工业上被广泛使用,但因热稳定的不足限制了它的使用前景。本研究以Bacillus pumilus ML413来源的血红素过氧化氢酶(Kat X2)为研究对象,采用定点突变技术提高其热稳定性及催化效率。利用Po PMu Si C algorithm软件计算并预测了其潜在突变位点的折叠自由能,根据预测的结果,选择了其中自由能最低的3个位点(K117V, K117I和K117M)进行突变。结果发现,对K117位点进行突变,可以有效提高Kat X2的热稳定性,突变体K117V在60℃下半衰期比野生型Kat X2提高38 min,催化效率较突变前提高31.7%。根据结构分析发现,该点突变并未改变Kat X2的二级结构。突变体K117V具有良好的工业应用潜力。     

昆虫来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的酶学性质表征

选取突变体K49R进行分离纯化、酶学性质表征,并进行全细胞催化合成β-丙氨酸,旨在研究红粉甲虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,ADC)的酶学性质,并为生物法制备β-丙氨酸提供理论与技术支持。突变体K49R最适pH为6. 5,在pH 6. 0～7. 0之间保持稳定;最适温度为42℃,热稳定性较野生型提高1. 7倍;底物亲和力大幅提高,催化效率是野生型的1. 8倍。在培养基中添加10 g/L葡萄糖可以有效提高重组菌的生物量,以及重组酶的可溶性表达量;在全细胞催化合成β-丙氨酸体系中,添加磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate,PLP)可以缩短反应时间,提高催化效率。该研究开发了具有工业化潜力的工程菌,建立了绿色、高效的β-丙氨酸生物合成法,为β-丙氨酸生物合成的产业化奠定了重要基础。     

重组鱼腥藻脂肪氧合酶定点突变及突变酶酶学性质研究

重组鱼腥藻脂肪氧合酶(Ana-LOX)基因来自于Anabaena sp.PCC 7120。利用定点突变技术将Ana-LOX的421位和40位的缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala),获得突变体V421A、V40A和V421A/V40A。野生型Ana-LOX在50℃下半衰期为3.8 min。而突变酶V421A和V40A在50℃的半衰期分别为4.4 min和7.0 min。突变酶V421A/V40A的半衰期为8.3 min,与野生型Ana-LOX相比,提高了1.18倍。相对于野生酶,突变酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分别提高了4.83%、41.58%、80.07%。突变酶的最适反应温度均比野生酶(35℃)高5℃。改造后的突变酶更能适合工业生产的需要,对于实际应用具有重要价值。     

Arg54保守位点对嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶的底物适应性和催化效率的影响

嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶(thermophilus sarcosine oxidase, TrSOX)是一种N-甲基脱除酶,对底物具有特异的手性选择性并且对高温和有机溶剂具有良好的耐受性。在同源家族中,Arg54是催化中心严格保守的5个残基之一,为了研究该位点对酶学性质的影响并筛选出具有良好催化效率的突变体,在预先构建的木糖诱导质粒pMA5-Pxyl-trsox中进行Arg54位点的定点饱和突变,并将得到的质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行表达。在19个突变体中,共有15个突变体可以表达并进行制备,其中几乎所有突变体的粗酶液蛋白含量相较野生型TrSOX都有所降低,只有R54D提高约2.5倍。所有突变体都保持了优异的热稳定性,除R54Q、R54N、R54K、R54D和R54V外,其他大多数突变体的二级结构组成均受到一定影响。突变体对底物的手性特异性与野生型TrSOX相同,能特异性识别N-甲基-L-氨基酸类底物,并能将甲基脱除。R54D和R54K对N-甲基-L-氨基酸类底物的催化效率显著提高,而其他突变体的催化效率降低甚至完全失活。此外,包括R54P、R54K和R54I在内的一些突变...     

通过定点突变提高纳豆激酶的酶活及热稳定性

纳豆激酶(Nattokinase,NK,EC3. 4. 21. 62)是日本传统食品纳豆在发酵过程中产生的具有很强溶栓活性的枯草杆菌蛋白酶,热稳定性较差,不利于在工艺生产中高温环节保证酶活,限制了其生产应用。在蛋白质中,脱酰胺过程将天冬酰胺和谷氨酰胺转化为带负电的天冬氨酸和谷氨酸,可能改变蛋白质的结构进而影响酶的活性、最适p H值和稳定性等。因此,模拟此过程可以高效改造目的酶。为提高纳豆激酶的酶活及稳定性,将位于纳豆激酶表面的天冬酰胺和谷氨酰胺分别突变为天冬氨酸和谷氨酸。通过筛选得到酶活提高突变体Q59E(约为野生型酶的1. 54倍)以及热稳定性提高的突变体N218D。双突变体Q59E-N218D的热稳定性进一步提高,半衰期(t_(1/2),33 min)提高为野生型酶(t_(1/2),12 min)的2. 75倍,并且酶活达到与原始酶相似水平。     

鱼腥藻脂肪氧合酶热稳定性提高的分子动力学模拟

为提高鱼腥藻脂肪氧合酶(Anabaena sp.PCC 7160 lipoxygenase,Ana-LOX)的热稳定性,探索其热稳定性机制。通过同源建模预测了Ana-LOX的三维结构,并通过分子动力学模拟技术手段分别模拟了Ana-LOX于298 K和320 K条件下在水溶液中的运动轨迹,计算均方根偏移与均方根涨落后,以均方根涨落为热稳定性评价指标,结合作用力分析,预测不稳定区域。结果表明:Ana-LOX的T94、I96、A325~Q327区域柔性较大,是导致Ana-LOX热不稳定的关键区域。通过I96V定点突变后,半衰期提高到野生型的2.5倍,验证了原预测结果的有效性,从而为脂肪氧合酶分子的热稳定性改造提供了理论依据。     

基于理性设计提高1,3-丙二醇氧化还原酶的稳定性和活性

1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol oxidoreductase, PDOR)是甘油生物合成1,3-丙二醇(1,3-propanediol, 1,3-PD)的关键限速酶之一。使用PoPMuSiC 2.1计算肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)来源PDOR(KpPDOR)突变的折叠自由能，结合HotSpot Wizard 3.0对催化中心附近氨基酸的功能热点分析和保守残基鉴定，理性选取突变位点，构建定点突变。经诱导表达、蛋白纯化和酶学性质研究，获得催化性能、热稳定性和pH耐受性提高的突变体。V155N突变体在37℃,pH 7.5下的还原活性为KpPDOR的1.7倍，pH 4.0时是KpPDOR的2.5倍。N262E突变体37℃下半衰期为KpPDOR的1.4倍。分析蛋白结构，发现Val155突变为Asn导致新形成两个氢键，稳定了Val155所在的β-折叠结构。而Asn262突变为Glu形所成的两个氢键，可增强催化中心刚性，提升酶稳定性。静息细胞转化甘油合成1,3-PD,发现突变体V155N工程菌株1,3-PD产能为1.16 mmol/L/OD     

重组脂肪氧合酶分子改造

脂肪氧合酶(Lipoxygenase,EC1.13.11.12,LOX)是一种双加氧酶,它能够专一催化多元不饱和脂肪酸中的cis,cis-1,4-戊二烯结构,通过分子加氢形成具有共轭双键的氢过氧化物。LOX在食品、医药和化工等领域都有广泛的应用,市场需求巨大。但微生物来源的LOX往往具有热稳定性较差的缺点,这限制了LOX在工业加工中的应用,因此提高酶的热稳定性对提高酶的应用价值和降低工业成本具有重要意义。在脂肪氧合酶N端与C端结构域链接处的loop结构(L6)分别插入1~3个L6序列,构建突变体L6 Ⅰ、L6 Ⅱ、L6 Ⅲ。3种突变体均可以在大肠杆菌中正常分泌表达,突变体的二级结构和三级结构与野生酶没有明显差异。L6 Ⅰ、L6 Ⅱ、L6 Ⅲ 3个突变体在50℃下的热稳定性分别是野生酶的2.3倍、3.2倍和4倍,其中突变体L6 Ⅱ、L6 Ⅲ的最适反应温度比野生酶提高了5、10℃。突变体的比酶活分别降低为野生酶的28.7%、57.9%和47.6%,同时其疏水性比野生酶提高了约300%。     

北京棒杆菌Corynebacterium pekinense天冬氨酸激酶P184M酶动力学分析及酶学性质表征

目的研究北京棒杆菌天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)184位点脯氨酸(proline,P)突变为蛋氨酸(DL-methionine,M)对酶动力学及酶学性质的影响。方法对北京棒杆菌AK家族同源序列比对,选择出高度保守且远离底物结合位点的Pro184位点,对其进行饱和定点突变,成功构建突变体P184M。结果动力学和酶学性质研究表明:P184M AK Vmax比WT(wide type)提高了5.06倍;n值为0.19,突变体由WT的正协同性变为负协同性,同时Km(mol/L)值增大;突变体AK最适pH为6.5,低于野生型最适pH 7.0;最适反应温度28℃,低于WT的30℃,适宜温度区间变窄;半衰期由WT的2.1 h降为1.2 h;金属离子、有机溶剂和抑制剂Thr+Met、Lys+Met、Thr+Lys+Met对突变株AK均表现出激活作用。结论突变体天冬氨酸激酶P184M的酶动力学性质和酶学性质改变显著,为构建高产蛋氨酸菌株提供了一定的参考依据。     

北京棒杆菌新型天冬氨酸激酶双突变株Y198N/D201M的构建及酶学性质表征

利用定点突变提高天冬氨酸族氨基酸合成途径中的首个关键别构酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)活力,并解除其受到代谢产物赖氨酸(Lys)与苏氨酸(Thr)的协同反馈抑制。在获得北京棒杆菌单体AK并分析结构的基础上,选取ATP周围的关键残基位点Tyr198和Asp201进行饱和定点突变,采用高通量筛选方法成功获得了酶活力提高到18.26倍的双突变体Y198N/D201M,动力学结果显示,K_m值由野生型(wild type,WT)的3.58 mmol/L减小到2.37 mmol/L,与底物亲和力增强;n值由WT的1.91减小到1.58,正协同性降低。酶学性质研究表明:双突变体Y198N/D201M最适反应温度由WT的25℃增至28℃,最适pH值由WT的8.0降至7.5,半衰期由WT的4.66 h延长至5.32 h。突变体Y198N/D201M较WT,在各个抑制剂浓度下活性抑制作用表现出不同程度的减弱,甚至在5 mmol/L和10 mmol/L Lys+Met、Thr+Met和Lys+Thr+Met条件下有激活作用。     

α-淀粉酶热稳定剂及失活动力学研究

α-淀粉酶在高温条件下半衰期短,易失活,提高其热稳定性的方法有:添加稳定剂、化学修饰、固定化等.研究了加入热稳定剂醋酸钙、乳酸钠后α-淀粉酶的热稳定性及失活动力学,测定了半衰期(t1/2)、失活速率常数(k)、活化能(Ea)等参数.结果表明,在α-淀粉酶中加入0.01 mol/L醋酸钙后,80℃酶的半衰期(t1/2)从<1.8 min提高到89.9 min,加入0.02 mol/L乳酸钠后提高到167.1 min,大大提高了α-淀粉酶的热稳定性;未加热稳定剂的淀粉酶失活动力学符合一级反应(R2>0.99);添加热稳定剂后酶的失活动力学发生变化,但失活中后期符合一级反应(R2>0.98).     

D-甘露糖异构酶的酶学性质探究和热稳定性改造

D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化，在D-甘露糖的生物酶法制备中具有应用前景，但是目前报道的D-甘露糖异构酶热稳定性较差，无法满足工业生产高温的需求。该研究将大肠杆菌(Escherichia coli) Dh5α来源的D-甘露糖异构酶异源表达后进行酶学性质研究，并对其进行热稳定性改造。研究结果显示D-甘露糖异构酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH值为6.0～7.0,K_m、k_cat和k_cat/K_m分别为963.4 mmol/L、1.38 s^-1、1.4×10^-3 L/(mmol·s)。通过理性改造该研究获得了一株热稳定性显著提高的突变体A241P/A116V/G253A/Q379P,其最适反应温度提高了15℃,在50℃条件下，半衰期为野生型的33倍，相对酶活力比野生型高60%。分子动力学模拟分析表明脯氨酸的引入和疏水作用的增强，提高了蛋白质的刚性，从而使热稳定性提高。该研究通过对主流来源的D-甘露糖异构酶进行酶学性质探究及热稳定性改...