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1.
α-L-鼠李糖苷酶是一种具有重要应用价值的诱导酶。目前,α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系尚不明确。本文以柚皮苷为诱导物培养棘孢曲霉产α-L-鼠李糖苷酶,研究该酶的结构及酶学性质特征。经质谱分析该α-L-鼠李糖苷酶属于棘孢曲霉α-L-鼠李糖苷酶A。三维结构模拟发现该α-L-鼠李糖苷酶具有N端β-折叠结构域、C端β-折叠结构域、clan-L(alpha/alpha)(6)-桶状催化结构域以及具有Asp等九个完全保守氨基酸残基,说明该酶属于糖苷酶78家族成员。分子对接发现该酶通过酸碱催化的机制水解柚皮苷。该酶的最适温度50℃,最适pH 4.0,1 mM与10 mM的Ag+、Fe~(2+)及Fe~(3+)对该酶有较强的抑制作用;该酶可以水解柚皮苷、橙皮苷和杨梅苷,其水解柚皮苷的动力学符合典型的米氏方程,Km值为0.23 mM,Vmax为565.1 U/mg。以上结果丰富了α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系的研究理论,为开发性质优良的α-L-鼠李糖苷酶提供了信息参考。  相似文献   

2.
利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,成功异源表达了一株链球菌(Streptococcus)S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中(pH 7.5~10.0)及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷(pNPG)的最大水解速率(Vmax)为508.38 μmol/(min·mg),米氏常数(Km)值为1.2 mmol/L;通过薄层层析(TLC)法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。  相似文献   

3.
以聚乙烯醇、海藻酸钠为载体,固定化柚苷酶;以戊二醛为交联剂,考察固定化工艺条件对酶活的影响,研究固定化酶的部分酶学性质。用高效液相色谱法分析柚苷酶的α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶活力,结果表明:最佳载体组合为11%聚乙烯醇与0.5%海藻酸钠;当缓冲液p H 4、戊二醛含量1%、交联时间0.5 h、吸附时间3 h、加酶量141 U/m L、硼酸4%、Ca Cl21%时,固定化酶活力达到最大值。柚苷酶固定化后,α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶活力的最适温度提高5℃,最佳活性p H值提高1.0,p H稳定性基本不变,温度稳定性下降5℃。α-L-鼠李糖苷酶、柚苷酶的米氏常数(Km)固定化后都增大;α-L-鼠李糖苷酶的最大反应初速度(Vmax)经固定化后减小,柚苷酶的Vmax增大。将固定化柚苷酶重复使用7次后,它的α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶残余活力分别保持71%与80%。  相似文献   

4.
α-L-鼠李糖苷酶可特异性切除糖苷类化合物上连接的α-L-鼠李糖基,已被广泛用于食品、医药等工业领域。作者旨在获得耐受高温的α-L-鼠李糖苷酶,提高工业生产的效率和降低使用成本。首先对嗜热菌Sulfolobus islandicus来源的α-L-鼠李糖苷酶基因进行克隆及大肠杆菌的异源表达,随后测定了系列酶学性质,接着优化了该酶制备异槲皮素的酶法制备工艺。结果表明:重组酶SisRha在90 ℃下酶活力最佳,具有极好的热稳定性,其在80 ℃下孵育120 min后酶活力几乎没有损失;最适反应pH为5.5,在pH 4.5~7.0时,pH稳定性良好;重组酶SisRha对人工底物对硝基苯酚鼠李糖糖苷(pNPR)的Km值为(0.15±0.03) mmol/L,Vmax值为(6.26±0.51) U/mg,kcat值为(10.48±0.86) s-1;对底物pNPR、芦丁、朝藿定C、柚皮苷、橘皮苷和淫羊藿苷的比活力分别为25.06、11.89、6.74、3.14、2.77、0.42 U/mg。重组酶SisRha转化芦丁生成异槲皮素的适宜工艺为:用酶量0.4 U/mL ,在85 ℃、pH 5.0的条件下反应1 h,可将2 mmol/L芦丁几乎全部转化,摩尔转化率高达98.56%。本研究丰富了现有的α-L-鼠李糖苷酶资源,为嗜热菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的研究奠定了基础,同时提供了一种高温转化芦丁制备异槲皮素的方法。  相似文献   

5.
从解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)基因组DNA扩增获得两个α-L-鼠李糖苷酶基因PhRha78E和PhRha78G,构建于表达载体pET-28a;将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达,PhRha78E和PhRha78G以不溶性包涵体形式大量表达于沉淀中,每克菌体可分别获得0.42?g和0.39?g含目的酶包涵体的沉淀。酶活实验显示二者的不溶性包涵体具有催化活性,可以催化水解底物对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenol-α-L-rhamnopyranoside,PNPR),表明二者在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达。PhRha78E和PhRha78G的最适反应pH值相近,分别为6.5和7.0,PhRha78E在酸性pH?4.8仍能保持62%酶活力,而PhRha78G在碱性pH?8.6依然保持72%酶活力;PhRha78E和PhRha78G的最适反应温度却相差很大,分别为60?℃和40?℃,PhRha78E在高温70?℃条件下仍能保持69%酶活力,而PhRha78G在低温20?℃条件下仍有43%酶活力;动力学常数kcat分别为0.18?s-1和0.12?s-1,Km分别为0.55?mmol/L和0.40?mmol/L。本研究揭示新型α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E和PhRha78G在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达,蛋白表达量大,二者酶学性质差异较大,可应用于不同的生物催化领域,并丰富了现有α-L-鼠李糖苷酶资源库。  相似文献   

6.
为了提高α-L-鼠李糖苷酶的发酵产量,利用高效液相色谱法检测α-L-鼠李糖苷酶活力,考察外加碳源葡萄糖、氮源及生长因子对棘孢曲霉JMUdb058固态发酵产α-L-鼠李糖苷酶的调控机制,并以之为依据优化培养基。研究结果表明,葡萄糖和淀粉对α-L-鼠李糖苷酶的产生具有代谢调节作用;外加氮源能大幅度提高α-L-鼠李糖苷酶的活力;相比用硫酸铵为氮源,用豆饼粉为氮源时,由于其中含有淀粉而导致酶合成量降低;磷酸氢二铵比其他铵盐和硝酸盐更能促进α-L-鼠李糖苷酶的合成。添加富含氨基酸的生长因子有利于α-L-鼠李糖苷酶的合成。棘孢曲霉JMUdb058发酵产α-L-鼠李糖苷酶优化后的培养基是:柚皮5 g,磷酸氢二铵0.5 g,酵母浸膏0.075 g,水5 m L,此时α-L-鼠李糖苷酶活力达到10.60 IU/gds,比初始培养基的酶活力提高了84.67%,比其他文献报道的最高酶产量提高了1.5倍。优化后的培养基大幅度提高了棘孢曲霉固态发酵α-L-鼠李糖苷酶的活力,为该酶的发酵生产及开发利用提供了技术参考。  相似文献   

7.
α-鼠李糖苷酶最佳测定条件的建立及酶学性质研究   总被引:3,自引:0,他引:3  
对α-鼠李糖苷酶酶活的最佳测定条件及部分酶学性质进行了研究,结果表明,α-鼠李糖苷酶的最佳测定条件为:以pH4.1的磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲液,5mmol/L的pNP-Rha为底物,于45℃恒温水浴中反应4min,立即加入2ml1mol/LNa2CO3溶液终止反应,400nm测定其O.D值。α-鼠李糖苷酶适于酸性环境,最适pH4.1;该酶为热不稳定性酶,其稳定的温度范围为35~55℃;以pNP-Rha(对硝基苯基-鼠李糖苷)为底物,Km值为47.84mmol/L,Vmax为75.12U。  相似文献   

8.
α-L-鼠李糖苷酶是一种在食品、药品中有重要用途的糖苷酶,但其结构与功能关系尚不明确,限制了优良酶制剂的设计。本文通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和亲和层析从塔宾曲霉固态发酵柚皮产物中分离纯化得到了一种α-L-鼠李糖苷酶,纯化倍数和比活力分别为34和21105 IU/mg,SDS-PAGE测得该酶的分子质量为120 ku;纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶最适反应p H为4.0,最适反应温度为50℃,p H稳定性和热稳定性好;Fe~(2+)对酶活有促进作用,Mn~(2+)、Ca~(2+)、Cd~(2+)对酶有抑制作用;该酶可水解柚皮苷,但对芸香苷和对硝基苯酚鼠李糖的转化率较低,不水解杨梅苷和柴胡皂苷C。以上结果表明纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶在金属离子影响特性、底物特异性方面具有新颖性,丰富了α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系研究素材。  相似文献   

9.
PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)基因组扩增获得1个全长1 790 bp的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,基因含有1个50 bp的内含子序列,其对应的蛋白质序列含有5个O糖基化位点和9个N糖基化位点,N端含有18个氨基酸的信号肽序列。将目的基因与表达载体pPICZαA连接并在毕赤酵母X-33诱导表达,获得重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。重组酶的相对分子质量为70 kDa,最适反应pH和温度分别为pH 5.5和50℃;金属离子Cu~(2+)、Zn~(2+)和Fe~(2+)对重组酶的酶活有抑制作用,Fe~(3+)对重组酶的酶活有促进作用;以4-Nitrophenylα-L-arabinofuranoside为底物测得酶的Km值和Vmax值分别为0.78 mmol/L和2.57μmol/(min·mg)。在大麦麦芽协定糖化的初始阶段添加31.2 mU/g重组酶,麦汁的过滤速度提高了12.8%。以大麦麦芽阿拉伯木聚糖为底物,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶有较好的协同作用。  相似文献   

10.
为了了解我国商品淫羊藿的质量现状,为淫羊藿功能性食品的生产提供依据,采用高效液相色谱法测定了33批市售淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C与淫羊藿苷的含量,采用紫外分光光度法测定了总黄酮的含量,采用DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)与ABTS(2,2’-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐)方法分析了淫羊藿醇提物的抗氧化活性。结果发现,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷与总黄酮的含量分别在0.37~3.01、0.25~5.22、0.46~19.27、0.41~13.40、18.29~68.73mg/g范围内,淫羊藿醇提物清除DPPH自由基与ABTS+自由基的EC50值分别在0.27~3.51、4.71~21.96μg/mL范围内,所有淫羊藿样品的DPPH自由基清除率均高于抗坏血酸(VC)。不同地区商品淫羊藿中黄酮类化合物含量及抗氧化活性差异较大。淫羊藿醇提物的抗氧化活性与朝藿定C、总黄酮之间具有较高的相关性(相关系数在0.5648~0.8626之间),与朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷的相关性较低(相关系数在0.3550~0.6395之间)。  相似文献   

11.
α-L-鼠李糖苷酶的研究进展   总被引:2,自引:1,他引:2  
α-L-鼠李糖苷酶是一种水解酶,可以作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α1连接的糖苷键,广泛存在于自然界的细菌和真菌中。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的结构不同,其催化特性也不尽相同。α-L-鼠李糖苷酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。该文综述了α-L-鼠李糖苷酶的来源、分类、特性及应用等。  相似文献   

12.
此项目研究了新疆野生樱桃李叶乙酸乙酯活性部位中的黄酮类化学成分。采用甲醇浸泡提取野生樱桃李叶,依次采用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取其醇提物。乙酸乙酯活性部分采用MCI (Middle Chromatogram Isolated Gel)大孔树脂柱粗分离,后续进一步采用硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱,ODS (Octadecyl silane)反向硅胶柱和制备HPLC等色谱技术对其进行分离纯化,并根据化合物理化性质和核磁共振波谱(NMR)数据并与相关参考文献比对鉴定化合物结构。从野生樱桃李叶中共分离并鉴定11个黄酮类化合物,分别为:槲皮素-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(1),槲皮素-3-O-β-D-木糖苷(2),槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷(3),槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(4),山柰酚-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(5),山柰酚-3-O-β-D-木糖苷(6),山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(7),山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(8),反式-二氢山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(9),顺式-二氢山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(10),顺式-二氢山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(11)。所有黄酮类成分均为首次从新疆野生樱桃李叶中分离鉴定,槲皮素和山柰酚糖苷是其主要的黄酮类成分。  相似文献   

13.
对比研究了三华李果肉、果核及叶乙醇提取物的总酚、总黄酮含量及其抗氧化活性。三华李叶提取物总酚、总黄酮含量最高,分别为14.75 g没食子酸当量/100 g提取物和5.45 g儿茶素当量/100 g提取物,且三华李叶具有最强的DPPH自由基清除能力(IC50值为79.75μg/m L)及氧自由基吸收能力(ORAC值为6521.74μmol trolox equiv/g)。采用柱层析法,从三华李叶中分离得到三个黄酮类化合物,通过核磁共振法(NMR)及电喷雾质谱法(ESI-MS),鉴定为山柰酚-3,7-二-O-α-L-鼠李糖苷,山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷以及山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷,三个化合物均为首次从三华李叶中分离得到。其中,山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷具有最强的DPPH自由基清除能力(IC50为12.93μg/m L)及氧自由基吸收能力(ORAC,8.83μmol trolox equiv/μmol)。山柰酚-3,7-二-O-α-L-鼠李糖苷是三华李叶中含量最多的化合物。因此,三华李叶可作为有效的抗氧化剂用于保健食品。  相似文献   

14.
提高酶热稳定性是工业酶属性改造的重要目标。山梨醇作为广泛应用于提高酶稳定性的外源添加剂,目前对其影响酶热稳定性的机制仍不明确。因此,作者以黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶(r-Rha1)为研究对象,通过热失活动力学、圆二色谱和荧光光谱的谱学分析,研究山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性的影响机制。结果表明,在60~70℃下,加入山梨醇可改善α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性;在60、65、70℃条件下,加入1.2 mol/L山梨醇可分别将半衰期提高29、25、10倍;圆二色谱和荧光光谱结果表明山梨醇通过增强α-L-鼠李糖苷酶的表面疏水活性和结构刚性,从而提高其热稳定性。通过探究山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性的影响,进一步证明山梨醇提高酶热稳定性的普遍适用性,同时为后续α-L-鼠李糖苷酶的工业应用提供了参考。  相似文献   

15.
在5 L发酵罐中对α-L-鼠李糖苷酶进行小试发酵,制备酶液;以聚乙烯醇-海藻酸钠为包埋载体,以戊二醛为交联剂对该酶进行固定化。经5 L罐高密度发酵96 h,α-L-鼠李糖苷酶酶活为2 766 U/g,生物量为228g/L。经过固定化后,α-L-鼠李糖苷酶的酶活为20 U/g,酶活回收率为32.88%,固定化α-L-鼠李糖苷酶的最适反应温度为35~50℃,最适反应p H值为4.0,该固定化酶在连续使用6次后酶活仍然保留98.22%。高密度发酵能显著提高酶的产量,同时固定化技术提高了酶的重复利用率,为该酶利用芦丁酶法转化制备异槲皮苷提供了依据。  相似文献   

16.
《中国食品添加剂》2020,(2):106-112
L-鼠李糖苷酶广泛应用于食品加工、医药及医药前体的制备。研究从海洋样品中筛选产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,对菌株进行鉴定,并对α-L-鼠李糖苷酶粗酶性质进行测定。通过透明圈平板筛选法从海州湾海域海泥样品中筛选获得一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌菌株DTC03。通过形态学特征、生理生化特性,以及16SrDNA序列的扩增与分析,将菌株DTC03鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。对菌株DTC03α-L-鼠李糖苷酶粗酶液酶学性质进行测定,该酶最适催化温度和pH分别为40℃和pH7.0;在50℃范围内保持1h后,剩余酶活力高于50%;在pH6.0~8.0的缓冲液放置12h后,仍有60%以上酶活。金属离子Ba~(2+)和Al~(3+)对酶有显著激活作用,而Ni~(2+)、Cu~(2+)和Cd~(2+)对酶有显著抑制作用。目前尚未见Bacillus velezensis产α-L-鼠李糖苷酶的报道,研究结果为该酶的进一步研究奠定实验基础。  相似文献   

17.
以不同来源的β-葡萄糖苷酶水解刺梨槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷,探讨提高刺梨黄酮苷元释放能力的生物转化途径。以槲皮素含量与糖苷转化率为指标,采用高效液相色谱法对来源于嗜酸乳杆菌、木霉和杏仁的β-葡萄糖苷酶水解3种槲皮素糖苷的转化率及槲皮素含量进行动态监测,以酶解时间、酶解pH值、酶解温度和酶用量(酶与底物质量比)为单因素,考察各因素参数独立变化对指标的影响,再以Box-Behnken 方法研究各因素及其交互作用对转化率的影响,优化工艺条件。杏仁β-葡萄糖苷酶水解3种糖苷转化所得槲皮素含量最高,对不同底物的转化率由高到低依次为槲皮素-3-O-葡萄糖苷(74.10%)、槲皮素-3-O-芸香糖苷(64.30%)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(31.80%)。杏仁β-葡萄糖苷酶优化水解工艺条件为酶解时间28.90min,酶解pH值4.9,酶解温度52℃,酶用量0.08%。此条件下得到槲皮素-3-O-芸香糖苷转化率71.48%,槲皮素-3-O-鼠李糖苷转化率36.32%,槲皮素-3-O-葡萄糖苷转化率77.86%。  相似文献   

18.
对地杆菌α-L-岩藻糖苷酶进行分子改造,以提高其酶法合成2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)的转化效率。利用易错聚合酶链式反应构建了α-L-岩藻糖苷酶的突变体文库,筛选得到一个合成2’-FL转化率提高的突变酶(mPbFuc29A1)。酶学性质研究结果表明mPbFuc29A1的最适pH值和温度分别为pH 5.0和40 ℃,最适温度较野生型PbFuc29A1提高了5 ℃;突变酶水解2’-FL的比活力提高到3 倍,但是水解4-硝基苯基-α-L-岩藻糖苷(4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside,pNP-FUC)和3’-岩藻糖基乳糖(3’-fucosyllactose,3’-FL)的比活力分别降低了22.8%和52.5%。以pNP-FUC和乳糖为底物,采用mPbFuc29A1酶法催化合成2’-FL和3’-FL,转化率分别为23.6%和56.4%,其中2’-FL的转化率较PbFuc29A1提高了9.1%。通过序列及定点突变分析发现mPbFuc29A1的氨基酸序列中有2 个位点发生突变(Asp21Val和Glu266Lys),其中位于loop区的Glu266Lys可能是mPbFuc29A1底物特异性和转糖苷产物组成发生改变的关键。优良的酶学特性使mPbFuc29A1在2’-FL合成中具有较大的应用潜力。  相似文献   

19.
从百子菜(Gynura divaricata(L.)DC.)中分离得到9个化合物,根据理化性质和波谱数据,分别鉴定为山柰酚-3-O-α-L-鼠李吡喃糖苷(1)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李吡喃糖苷(2)、4-桉叶烯-3α,11-二醇(3)、caryolane-1,9β-dio(l4)、阿魏酸(5)、松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(6)、莨菪亭(7)、姜油酮-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(8)和5,5-二甲基-4-羟基-四氢呋喃-2-酮(9)。除化合物2外,其余化合物均首次从该属中分离得到。  相似文献   

20.
建立了一种基于高分辨质谱库和特征组分诊断比值法鉴别食品中非法添加淫羊藿的方法。采用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪构建淫羊藿6种特征组分高分辨质谱库进行初步筛查,将不同产地和采摘时间的淫羊藿中药材模拟配制酒、代用茶和饮料样品,构建3种基质中淫羊藿特征组分液相色谱分析方法,选取受产地、采摘时间、加工工艺等影响较小,不同基质组间无显著性差异的3组特征组分峰面积诊断比值DR1(朝藿定A/朝藿定B)、DR3(朝藿定A/淫羊藿苷)和DR7(朝藿定B/淫羊藿苷),合并后绘制箱图确定各诊断比值非异常值范围分别为0.60~0.96、0.26~0.64和0.35~0.91,以此作为鉴别指标。对实际样品配制酒、代用茶及饮料进行分析,1批次配制酒样品与淫羊藿6种特征组分高分辨质谱库匹配一致,且3组特征组分诊断比值DR1、DR3、DR7分别为0.73、0.28、0.38,均在规定区间内,推断该配制酒样品中加入了淫羊藿中药材。该方法准确、快捷、稳定性好,可快速鉴别食品中非法添加淫羊藿,为打击食品中非法添加淫羊藿违法行为提供技术支撑。  相似文献   

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