南极假丝酵母脂肪酶B的固定化及其在合成维生素A棕榈酸酯中的应用

从10种树脂中筛选出3种固定化效果较好的树脂ECR1030M、LX-1000EP和MC150EP,优化南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法.其物理吸附法固定化的最佳参数为:介质为pH 8.0或6.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液,18 g/L酶液和树脂按20∶1(V/W)比例混合,30℃、180 r/min固定化3h,应用于维生素A棕榈酸酯合成研究,所得固定化脂肪酶的酯化比酶活分别为1 055.7 U/g(ECR1030M树脂)、1 077.0 U/g (LX-1000EP树脂)和1 024.3 U/g(MC 150EP树脂),同时对固定化酶的性质进行了研究,其中,ECR1030M树脂固定化酶表现出更好的操作稳定性,重复使用7个批次反应后,固定化CALB的残余酶活90％以上,维生素A棕榈酸酯的产率达85％以上.     

酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的酶学性质研究

本文对酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的-般酶争I生质进行研究,得出如下结论:酵母表面展示CALB在碱性条件下具有很好的稳定性和水解活性.其水解对硝基苯酚酯的最适反应pH值范围是8.0～8.5,与游离的CALB商品酶相比,向碱性条件偏移.最适反应温度范围是40～45℃.最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯,表现出极为明显的底物特异性.Ca2 、Mg2 对其有明显的激活作用.K 对其有微弱的激活作用.而Co2 、Cu2 对其有明显的抑制作用.本研究为酵母表面展示脂肪酶的应用研究奠定理论基础.     

南极假丝酵母脂肪酶B的克隆、表达及发酵条件优化

从原始菌株Candida antarctica ZJB09193出发,将南极假丝酵母脂肪酶B基因克隆至酵母表达载体pPICZαA,重组质粒线性化后导入表达宿主菌X-33,在甲醇诱导下,实现了CALB活性表达.从通气量、搅拌转速、初始pH、接种量和诱导剂量等方面对重组毕赤酵母的上罐发酵条件进行研究,最终确定通气量10 L/min,搅拌速度为800 r/min,初始pH 5.5,接种量10％,诱导剂量3500 mL可以达到较好的产酶量.确定DO为发酵控制的一个重要指标,在正确的溶氧校正下确保DO大于20％.     

皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1在毕赤酵母中的高效表达及其催化合成维生素E醋酸酯

本研究将经密码子优化的皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase) CRL1基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHKA,构建得到重组菌株GS115/pHKA-CRL1;经摇瓶发酵并结合甲醇诱导120 h处理,该菌株对底物对硝基苯酚丁酯(p NPB)的水解活力达到39.73 U/mL。通过对AOX1启动子和α分泌信号肽同时进行改造,进一步获得重组菌株GS115/pHKA-AOX1m/αm-CRL1,其脂肪酶活力提高达到63.63 U/mL。发酵液上清液经超滤浓缩、硫酸铵沉淀后,再经脱盐和阴离子交换层析处理,获得纯化的重组CRL1。该纯化工艺的纯化倍数为5.41倍,回收率为33.81%。而纯化重组CRL1的比酶活为984.5U/mg。重组CRL1的最适温度为40℃,最适pH为7.5;经40℃保温6 h,仍保留52.99%的相对活力;在偏酸性环境中较为稳定。以摇瓶发酵、真空冷冻干燥后的重组CRL1为催化剂,在无溶剂体系中催化合成维生素E醋酸酯,在最适反应条件下(200 mg D-α-生育酚、1 mL乙酸酐、100 mg CRL1、反应温度60℃、转速200 r/min、反应时间9 h),D-α-生育酚的转化率在97.00%以上。     

表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母FM22发酵培养基响应面优化

FM22培养基以中富的氮源、较强的适应性等优势,适用于毕赤酵母发酵。为进一步对毕赤酵母发酵表达南极假丝酵母脂肪酶B进行优化,选取培养基中对其影响较大的CaSO4、KH2PO4、（NH4）2SO4、PTM4为自变量,酶活力为响应值。通过单因素试验得自变量最佳值及高低水平,再采用Box—Behnken组合设计方法,模拟二次多项式同州方程的预测模型,研究各自变鼍及其交瓦作用埘酶活力的影响。最终得到自变最最佳值：KH2P0445．02g／L、（NH4）2s045．63g／L、CaS040．46g／L、PTM41．63mL／L,酶活力为3214．7U／gDCW,较优化前提高约40％。     

磁性多孔微球固定化假丝酵母脂肪酶的研究

通过悬浮聚合法制备了含环氧基团的聚合物载体高分子磁性多孔微球(GHD),用TEM、 SEM和Micromeritics ASAP 2010等对聚合物载体进行了表征。考察了载体中交联剂含量、固定化时间、给酶量等因素对固定化脂肪酶催化活性的影响。结果表明,Fe3O4纳米粒子粒径20 nm,分布均匀,磁性多孔微球粒径从几十微米到一百多微米,粒子大小大体呈正态分布且分布较窄,平均粒径为110 μm,直径在区间80μm~150μm范围内的粒子占90%以上。微球表面呈皱褶态且呈现多孔性,孔径从几个纳米到几十纳米,为闭孔,且孔间互相贯穿。固定化酶最适条件为给酶量125 mg/g,固定化时间7 h,此时酶的吸附量为118 .5mg/g,比酶活7.56×105 U/g,酶的活力回收率0.95。以GHD为载体制备的固定化脂肪酶最佳反应温度从37 ℃上升到42 ℃,最适反应pH从7.2提高到7.5,固定化后酶对温度和pH的敏感性降低,重复使用12次,固定化酶的活力都能保持在92 %以上。     

黑曲霉脂肪酶Lip A的异源表达与酶学性质分析

脂肪酶在油脂分解和脂质合成方面具有广泛应用,是一种很有前途的生物催化剂。该研究对来源于黑曲霉的脂肪酶Lip A进行了异源表达及催化特性研究。结果表明,该重组脂肪酶的最适温度为50℃,最适pH为8.0,并且在40～60℃和pH 5.0～8.0有较好的稳定性。该酶对有机试剂有较好的耐受性,金属离子Ca²⁺和Mg²⁺对脂肪酶水解活性有促进作用,Fe³⁺、Zn²⁺和Cu²⁺严重抑制该酶活性。反应动力学参数表明,对硝基苯酚乙酸酯是脂肪酶Lip A的最适底物,其反应K_m为(0.228±0.05) mmol/L,催化常数K_cat为(0.023±0.001) s^-1。生物信息学分析表明,脂肪酶Lip A是abH23同源家族Rhizomucor mihei脂肪酶中的一员。黑曲霉脂肪酶Lip A具有催化乳酸和乙醇生成乳酸乙酯特性,为其在酿造领域的应用奠定了基础。     

磁性聚合物微球固定化发酵液中脂肪酶

脂肪酶是一类功能多样且应用广泛的酶,但是由于游离酶活性易损失且难以分离回收,通常不适合实际应用。为了解决实际应用中游离脂肪酶的稳定性和重复使用性较差的问题,首先使用近平滑假丝酵母发酵生产脂肪酶,然后合成了聚酰胺-胺树枝状大分子接枝的聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球[Fe₃O₄@poly(methyl methacrylate)/polyamidoamine, Fe₃O₄@PMMA/PAMAM],并用多种方法对其进行表征。进一步将Fe₃O₄@PMMA/PAMAM作为载体用于固定化脂肪酶,最优固定化条件为戊二醛用量0.6 mL、固定化时间5 h、固定化pH 8.0、固定化温度35℃,所得的固定化脂肪酶活性为864 U/g,酶活力回收率为74.29%。与发酵液中的游离脂肪酶相比,固定化脂肪酶的热稳定性和pH稳定性均明显增强。在连续循环使用10次后,固定化脂肪酶仍能维持72.23%的酶活性。4℃下贮存30 d后,固定化脂肪酶仍能保留71.44%的酶活性。     

黑曲霉脂肪酶tglE的基因克隆与生化特征解析

从黑曲霉基因组中克隆了一种新的脂肪酶基因tglE,并在毕赤酵母中成功表达。重组酶具有典型的脂肪酶活性,其最适pH为7. 0,最适温度为40℃;在30～60℃或pH 6. 5～9. 0该酶的酶活力保持在60%以上;在pH 6. 0～8. 0或20～30℃均较为稳定。Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、K~+、Mg~(2+)和Sn~(2+)对tgl E有明显的激活作用; Fe~(3+)、Zn~(2+)和EDTA对重组酶的酶活抑制作用明显,特别是EDTA可抑制重组酶90%的活。tgl E对橄榄油和C_4底物的作用最强,对棕果油和C16底物的作用最弱。以C_4为底物,tglE的Km值为14. 40 mmol/L,Vmax为46. 72mmol/(m L·h)。tgl E具有催化辛酸和乙醇生成辛酸乙酯的酯化活性。     

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。      

溶菌酶LyAa在黑曲霉中的高效表达与酶学性质分析

该研究探讨了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后,构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达,利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具,使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2 291.37 U/mL,是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力（869.74 U/mL）的2.63倍,是仅使用传统单拷贝表达载体的LyAa-T菌株酶活力（358.41 U/mL）的6.39倍。通过6×His标签使用镍柱亲和层析成功纯化了重组溶菌酶LyAa,并对其酶学性质进行了分析。溶菌酶LyAa蛋白大小约为25.0 ku,最适pH值为4.0,最适温度为30 ℃,并显示出良好的胃蛋白酶稳定性。综上,该研究基于双拷贝载体和CRISPR技术成功优化和提高了溶菌酶在黑曲霉中的表达。     

黑曲霉B0201生料发酵产单宁酶的提取及酶学性质研究

对黑曲霉B0201利用五倍子为诱导物生料发酵产胞外单宁酶的提取及酶学性质进行了研究。结果表明:硫酸铵两步沉淀的饱和度为40%和90%;该酶的最适温度为40℃,最适pH为5·0,低于60℃时的热稳定性高,60℃以上迅速失活。Zn2+、Mg2+、吐温80、EDTA等对酶活力无明显影响,Fe3+、Cu2+、Fe2+、Ba2+、Mn2+、Ca2+、Al3+等对酶有抑制作用。以没食子酸丙酯（PG）为底物,单宁酶的米氏常数Km为0·514mmol/L,Vmax为71·8μmol/L·min。      

多聚半乳糖醛酸酶在黑曲霉中的超量表达及其酶学性质研究

运用基因工程手段,构建高效表达多聚半乳糖醛酸酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期更好的实现多聚半乳糖醛酸酶在食品加工、饲料生产及废水处理中的重要作用。从果胶酶生产菌黑曲霉GJ-1中扩增得到多聚半乳糖醛酸酶基因pgaB的成熟肽编码序列(1232 bp),集成glaA多拷贝强启动子和信号肽,构建其黑曲霉表达载体pSZHG6RS-pgaB,通过农杆菌介导法转化黑曲霉,获得多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉重组菌株。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为38 kDa;在发酵第10 d时酶活最高达到4617.8 U·mL-1。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为5.0,碱性耐受能力较强;Ca2+、Fe3+、Fe2+均对重组酶有一定激活作用;重组酶对不同底物的催化能力不同,甲酯化程度越高酶对其降解能力越弱,其中对无甲酯化的多聚半乳糖醛酸催化能力最强,DE值为33.04%。重组菌株产酶活性较高,具有明确的产业化前景。     

黑曲霉木聚糖酶（xynZF-2）基因克隆、表达及酶学性质分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉（Aspergillusniger）XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因（xynZF-2）的cDNA序列（Genbank登录号为：JQ700382）。该基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,其中成熟肽为107个氨基酸。以重组质粒pUCm-T—xynZF-2为模板,扩增得到编码xynZF－2成熟肽的cDNA片段（624bp）。将其与表达载体pET－28a连接,构建重组表达载体pET－28a—xynZF－2,并转化大肠杆菌（Escherichiacoh）BL21（DE3）,获得重组工程菌BL21／xynZF-2。经IPTG诱导表达,木聚糖酶的的比酶活最高可达42．33U／mg。重组表达的木聚糖酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为5．0,在碱性条件下具有良好的稳定性。Fe^3＋对酶的激活作用最为明显。     

耐热黑曲霉3.316产内切葡聚糖苷酶培养条件优化及酶学性质研究

以内切葡聚糖苷酶的酶活力为指标,采用单因素结合和响应面法对黑曲霉产内切葡聚糖苷酶的培养基组分进行优化,并研究内切葡聚糖苷酶酶学性质.结果表明:最佳培养基组分为小麦秸秆16.29 g/500 mL,硫酸铵2.24 g/500 mL,微晶纤维素+麦芽糖2.16 g/500 mL,在该条件下内切葡聚糖苷酶酶活力4.257 U...     

黑曲霉脂肪酶在反胶束体系中的光学特性及其催化合成己酸乙酯

研究黑曲霉脂肪酶在反胶束体系中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱特性,并优化黑曲霉脂肪酶在反胶束中催化合成己酸乙酯的反应条件,最后分离和鉴定产物。结果表明：在反胶束体系中黑曲霉脂肪酶的结构发生了变化,芳香族氨基酸暴露更多。黑曲霉脂肪酶催化合成己酸乙酯的反应条件为：在含有异辛烷-正己醇-水的体积比为60:4:1,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)添加量100mmol/L的反胶束体系中,脂肪酶质量浓度为0.003g/L,己酸浓度为0.3mol/L,酸醇物质的量比为1:0.9,反应温度为35℃,摇床转速为120r/min条件下16h时己酸乙酯的合成量达到最大,己酸的转化率达到(88.92±1.00)%。     

黑曲霉N5-5产单宁酶的酶学性质与固定化

本实验室自主分离的黑曲霉N5-5所产单宁酶已发现对没食子酸丙酯具有良好酶解效果。为了单宁酶的工业化应用,本次研究大批量培养单宁酶,探究其对单宁酸的酶解效果及酶的固定化效果。发酵采用先液体扩培后固体发酵的形式,提酶后利用陶瓷膜过滤技术纯化、浓缩酶液,并对比冷冻干燥和喷雾干燥两种不同干燥方式,还使用树脂载体对酶进行固定化。实验表明,纯化后单宁酶酶活达258.53 U/mL,可水解10%至50%浓度的单宁酸,其中30%以下底物浓度酶解效果较好;冷冻干燥对酶活影响不大而喷雾干燥使酶活降为174.02 U/mL;另外,单宁酶通过树脂载体固定化后,在实验条件下可重复使用至少4次。研究为提高黑曲霉N5-5发酵所产单宁酶的媒介效率、降低酶解反应成本、实现商业化生产建立了理论基础。