冷冻干燥法制备植物酯酶

以酯酶为试剂可以有效地检测有机磷农药的存在,在农残分析中已广泛应用,但目前还没有工业化酯酶产品。本文探讨了冷冻干燥制备植物酯酶干粉的方法,对冷冻干燥中装液厚度、干燥时间和保护剂选择等参数进行了实验研究。结果表明,在干燥过程中,酶液厚度增大会增加干燥时间,但对酶活力无显著影响;添加5%的聚乙二醇可以有效保护酶制剂在冷冻干燥过程中不失活,并且有良好的稳定性。     

木聚糖酶热稳定性化学修饰研究

采用不同化学修饰剂对毕赤酵母工程菌所产的木聚糖酶进行化学修饰,结果发现用聚乙二醇(diamino-PEG)对酶进行的化学修饰,提高了酶的热稳定性。通过对化学修饰木聚糖酶条件的优化,最终确定了修饰反应体系中,木聚糖酶、diamino-PEG和偶联剂(EDAC/NHS试剂)的摩尔比为1∶1 000∶100。该修饰反应得到的修饰酶,在55℃保温10 min后,残余酶活力为61.6%,比原酶提高了29.1%,通过对酶学性质的分析,发现修饰酶只有pH稳定性、热稳定性发生了改变。     

银耳多糖对冻干植物乳杆菌细胞膜及糖代谢酶的保护作用

为了探索银耳多糖作为益生菌冻干保护剂的潜在应用,该研究以植物乳杆菌为试验菌,通过测定植物乳杆菌冻干前后的活菌数、细胞膜性质以及糖代谢酶活力的变化,评价了银耳多糖复合酪蛋白酸钠对植物乳杆菌的冻干保护效果。结果表明：当银耳多糖与酪蛋白酸钠的复合比例为3:1时,菌的最大存活率达到55.39%,此时细胞内钙离子荧光强度显著降低,为29.98;DPH的荧光强度最低,为4.91;细胞内乳酸脱氢酶、钠钾ATP酶与钙镁ATP酶的活力最大,分别为0.32 U/mL、121.61 U/g与45.64 U/g。银耳多糖使膜受损的菌百分比从98.35%最大降低至37.90%。但冻干前后己糖激酶和丙酮酸激酶的活力无显著性变化。红外扫描结果表明银耳多糖与酪蛋白酸钠之间存在非共价相互作用;此外,银耳多糖的保护使菌粉表面的孔隙率降低,酪蛋白酸钠的复合则增加了菌粉的致密性。因此,银耳多糖在冷冻干燥过程中对植物乳杆菌细胞膜受到的损伤具有显著的抑制作用,对植物乳杆菌的乳酸脱氢酶、钠钾ATP酶及钙镁ATP酶具有明显的保护作用。     

新型脂肪胺荧光标记试剂的合成及小分子 脂肪胺的衍生检测

目的合成一种新的以荧光素为荧光团,N-羟基琥珀酰亚胺活性酯为反应基团的脂肪胺荧光标记试剂,并建立以新试剂标记短链脂肪胺并用高效液相色谱-荧光检测法进行分离的方法。方法在p H 8.5的Na2B4O7-H3BO3缓冲溶液中,25℃下,衍生试剂浓度为50μmol/L,衍生反应进行10 min,衍生物峰面积即可达到最大且稳定。结果在优化的条件下,建立的检测方法的线性范围为0.01~2μmol/L,线性回归系数0.999,检测限达到0.1~1μg/L。结论衍生后的产物利用高效液相色谱-荧光检测法,可以使得6种小分子脂肪胺得到有效分离,方法具有衍生速度快,灵敏度高等优点。     

多羟基化合物对凝乳酶热稳定性的影响

从分子结构与催化功能两个方面,探讨了多羟基化合物对凝乳酶热稳定性的影响.凝乳酶分别溶于不同多羟基化合物溶液,分别测定了热处理后残余酶活力和荧光发射光谱变化,并以多羟基化合物质量分数为自变量,以残余酶活力和荧光差谱曲线下面积为因变量进行三元线性回归分析.结果表明,残余酶活力依赖于多羟基化合物浓度,同质量分数下对凝乳酶的保...     

利用F_0F_1-ATPase分子马达技术检测志贺氏菌

利用载色体chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器,建立应用在食品检测中快速检测方法。首先从嗜热菌中提取载色体,合成生物素化宋内氏志贺氏菌IpaH探针,在载色体ATP合酶的ε亚基上连接ε亚基抗体-生物素-链霉亲和素-生物素-IpaH探针,将待测宋内氏志贺氏菌标准菌株和阴性对照分别与此生物传感器结合,比较其催化ATP合成10 min后的ATP产生量,进而对宋内氏志贺氏菌DNA进行检测。ATP合成的量可以通过luciferase-luciferin检测试剂所体现的荧光强度大小标定。结果表明,chroIpaH(连接在载色体chro上的IpaH探针)的浓度在0.031 mg/mL,宋内氏志贺氏菌DNA浓度在50 ng/mL为最适检测条件。通过与实际检测样品的传统检测方法及PCR检测方法对照,具有良好的检测符合性。     

呋喃唑酮代谢物时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡的研制及应用

目的应用时间分辨免疫荧光检测技术,研制出一种快速检测呋喃唑酮代谢物的试剂卡。方法采用EDC介导法偶联抗体,由于铕荧光微球的荧光持续稳定性好,强度大,不易受干扰等优点,将其作为荧光标记物。通过优化铕荧光微球与单抗之间的用量,改善试剂卡的显色梯度,提高试剂卡的灵敏度。结果结果显示本试剂卡对呋喃唑酮代谢物的检出限为0.5μg/kg,与呋喃唑酮代谢物类似物的交叉反应率低,可在室温条件下保存一年;此方法下的检测结果与液相色谱-串联质谱法的检测结果符合程度为100%。结论呋喃唑酮代谢物时间分辨荧光免疫快速检测试剂卡具有检测快速、准确、灵敏度高的特点,操作简单,能满足大规模现场快速检测的需求,为食品安全每个环节提供保障和便利。     

Pseudomonadaceae sp.胆固醇氧化酶产酶条件优化及其初步纯化

Pseudomonadaceae sp.可以发酵生产胆固醇氧化酶。本文对Pseudomonadaceae sp.进行产酶条件的优化及产物的初步分离。确定其最适培养基及培养条件,优化后胆固醇氧化酶的酶活力可达1691.72U/L,比优化前839.35U/L有较大提高。经过(NH4)2SO4沉淀及Sephadex G-75凝胶过滤层析初步纯化后酶比活力达24.95U/mg,纯化倍数为9.18。     

鸡血清胆碱酯酶的提取纯化工艺研究

以鸡血清为实验材料提取农药残留快速检测酶制剂胆碱酯酶,确定了鸡血清胆碱酯酶的最佳提取和纯化工艺,即对粗酶液进行盐析、透析、吸附层析和葡聚糖凝胶柱层析等实验方法。结果表明:鸡血清胆碱酯酶经过硫酸铵盐析,透析、吸附层析和Sephadex G-100柱层析处理后,酶活力分别提高了1.548、.21、9.03、13.00倍,冷冻干燥后酶活力提高了13.58倍,比酶活力由粗酶液中的0.538 OD值/mg提高到层析后的7.304 OD值/mg。     

LsrK激酶活力测定反应体系的优化及其稳定性研究

对群体感应淬灭酶LsrK的活力测定反应体系进行优化,测定LsrK的激酶活力和稳定性。以信号分子AI-2为底物,对反应体系中ATP浓度、发光波长和LsrK激酶浓度进行优化,利用Kinase-Glo发光试剂盒测定激酶活力,并在优化反应体系下测定LsrK激酶活力的稳定性。确定反应体系中ATP浓度为3μM,LsrK激酶浓度为15μM,发光波长为560nm;LsrK在30℃条件下,随时间延长,激酶活力逐渐降低,12h时酶活力基本完全消失。为进一步进行LsrK蛋白的功能研究及酶制剂的制备奠定了基础。     

复合保护剂对透明质酸酶的稳定性研究

以球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)A152发酵生产的透明质酸酶(HAase)的酶活力为衡量指标,通过研究糖类、醇类、生物大分子和金属离子等保护剂对提高透明质酸酶热稳定性的作用,考察添加复合保护剂对透明质酸酶热稳定性和储存稳定性的影响。结果表明,山梨糖醇、蔗糖和可溶性淀粉作为保护剂,可提高HAase酶的热稳定性。通过单因素和正交实验优化后得到了效果最佳的复合保护剂配方,即山梨醇7.5%、蔗糖10%、可溶性淀粉0.2%。优化后添加保护剂的HAase在42℃保温2 h后,其酶活保留率为88.68%,较对照提高了64.18%,在37℃,通过添加复合保护剂,其半衰期提高了48%。在4℃储藏90 d,添加复合保护剂和防腐剂(0.1%的山梨酸钾和0.05%的苯甲酸钠)的HAase酶活保留率高达85.52%。     

果胶酶在磁性复合载体上的固定化及其酶学性质

通过Fe3O4磁核与海藻酸钠明胶制备磁性复合载体,戊二醛交联后协同对果胶酶进行固定化,并研究固定化酶的酶学性质。利用正交实验优化固定化酶的制备条件,比较研究了固定化酶与溶液酶的酶学性质。结果表明:在Fe2+(5mol/L)∶Fe3+(5mol/L)体积比为0.75∶1的溶液中,制备Fe3O4磁核;3.5%海藻酸钠与3.0%明胶以2.5∶1的体积比,加入3.0mg/m L Fe3O4磁核量,在体积分数4.0%的戊二醛中交联2.5h;以每克载体加入20mg果胶酶,p H4.0下固定60min,制备的固定化果胶酶活力回收率可达78.69%。固定化果胶酶最适p H为4.0,在p H3.0~7.0内稳定;最适温度50℃,在20~50℃具有较好的热稳定性;表观米氏常数Kmapp为3.162mg/m L;重复使用10次后,酶活力还剩51%,4℃下储存10d,酶活力还保留81%。说明以戊二醛交联磁性海藻酸钠明胶为复合载体制备的固定化果胶酶,机械强度大、弹性好,酶活力回收率高,操作稳定性好。     

牛乳中蜡样芽孢杆菌高效环介导扩增检测方法建立

目的建立稳定的环介导恒温扩增体系(loop mediated isothermal amplification,LAMP)检测乳制品中蜡样芽孢杆菌的分析方法。方法设计5组引物,通过特异性、灵敏度等指标测试筛选出较好的引物对。后通过优化反应中关键试剂及浓度,检出蜡样芽孢杆菌。通过基因组干扰实验排除引物的假阳性干扰。并在牛奶中验证该方法的检测效率。结果最终筛选出一组特异性好的引物,该扩增方法经过优化后,在最适扩增体系可以检出10 fg/μL纯基因组DNA,用实时荧光定量实验进行对比验证可以检测出100 ag/μL的基因组DNA。抗干扰实验结果显示干扰组基因组核酸和培养菌液均对标准组无影响。该方法在检测牛乳中混合的菌落时呈现出良好的检测效果,可以检测出2.1×10~2 CFU/mL。结论本研究建立了高效、稳定、灵敏的恒温扩增体系,可以应用与牛奶中中蜡样芽孢杆菌的快速检测。     

以浒苔为碳源的地衣芽孢杆菌发酵产蛋白酶条件优化

为了优化地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）以浒苔（Enteromorpha prolifera）为碳源进行发酵产蛋白酶的能力,以蛋白酶比活力为指标,通过单因素试验探讨不同因素对产酶效率的影响,在此基础上运用Plackett-Burman设计筛选出了3 个显著因素：培养基初始pH值、浒苔添加量和NaH2PO4添加量。采用响应面法对这3 个显著因素进行优化,得到最佳产酶条件为培养基初始pH 6.66、浒苔添加量4.65%、NaH2PO4添加量0.027 4%,此条件下蛋白酶比活力预测值为66 354.70 U/g pro,3 次实验验证值为66 966.37 U/g pro。验证值与基础发酵条件下的最大蛋白酶比活力18 206.16 U/g pro相比,提高了2.68 倍。     

利用F0F1-ATPase分子马达生物传感器检测食品中的副溶血性弧菌

利用载色体上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器对副溶血性弧菌检测快速检测。在ATP合酶的ε亚基上连接ε亚基抗体-生物素-链霉亲和素-生物素-toxR探针,将待测副溶血性弧菌标准菌株和阴性对照分别与生物传感器结合后,比较其催化ATP合成30min后的ATP产生量,可以对副溶血性弧菌的DNA进行检测。ATP合成的多寡可以通过环境中H+的量进行测量,而H+的多寡通过F-DHPE所体现的荧光强度大小来获得。结果表明,chro toxR的质量浓度在0.156mg/mL,副溶血性弧菌DNA质量浓度在40ng/mL时为最适检出条件。通过与实际检测样品的传统检测方法及聚合酶链式反应检测方法对照,具有良好的符合性。     

工业蛋白水解酶快速检测方法的建立与初步应用

蛋白水解酶是一类重要的工业酶制剂,快速检测蛋白水解酶活力对新蛋白酶的发现、生产与应用极为重要。基于荧光共振能量转移原理,用氟硼荧荧光素标记大豆分离蛋白,以此为底物建立了一种快速检测蛋白水解酶活力的新方法。运用此方法检测5种工业蛋白酶,酶活在0. 025～0. 4 U/m L与荧光值呈现良好的线性关系,检测限范围为1. 1×10~(-4)～1. 4×10~(-4)U/m L,定量限范围为3. 7×10~(-4)～4. 5×10~(-4)U/m L,相比国标福林法灵敏度提高20 000倍以上。该方法灵敏度高、操作简便,在蛋白水解酶快速、微量检测及新型蛋白水解酶开发中具有应用潜力。     

利用分子马达技术检测霍乱弧菌

利用载色体chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器,建立了应用在食品检测中的快速检测方法。首先在ATP合酶的ε亚基上连接ε亚基抗体-生物素-链霉亲和素-生物素-ompW探针,将待测霍乱弧菌和阴性对照分别与此生物传感器结合,比较其催化ATP合成30 min后的ATP产生量,进而对霍乱弧菌的DNA进行检测。ATP合成的量可以通过环境H+的量进行测定,H+的量通过F-DHPE所体现的荧光强度大小标定。结果表明,Chro ompW的浓度在0.078 mg/mL,单核增生李斯特菌DNA浓度在40 ng/mL为最适检测条件。通过与实际检测样品的传统检测方法及PCR检测方法对照,具有良好的检测符合性。     

酰化和酶法修饰后牦牛乳酪蛋白热稳定性变化

采用酰化试剂和转谷氨酰胺酶(TG)对牦牛乳中的酪蛋白进行改性,并对改性后的酪蛋白进行热稳定性研究,通过在280nm处测定吸光度值来评价酪蛋白热稳定性。结果表明,酪蛋白经TG交联后热稳定性提高。采用不同酰化试剂修饰后,牦牛乳酪蛋白热稳定性增强,不同改性修饰的酪蛋白热稳定性差异较大,琥珀酸酐修饰酪蛋白热稳定性最强。结果可为牦牛乳酪蛋白修饰和产品开发及利用提供参考依据。     

大孔树脂法纯化黑豆酯酶的工艺优化

目的对采用大孔树脂法纯化黑豆酯酶的工艺进行优化,确定其最佳工艺条件。方法首先通过静态吸附和洗脱试验,以黑豆酯酶的吸附率和洗脱率为指标,筛选最佳树脂。然后进行动态吸附和洗脱试验,研究上样稀释倍数、洗脱剂体积分数和洗脱剂体积3因素对洗脱率的影响。最后以黑豆酯酶得率和比活力为指标,用L_(16)(4~3)正交实验进行优化。结果通过筛选发现,D301R树脂吸附率和洗脱率都较高。动态吸附和洗脱实验中获得最佳工艺条件为:上样稀释倍数为40倍,洗脱剂体积分数为60%,洗脱剂用量为20 mL。在此条件下黑豆酯酶得率为(89.39±1.65)%,黑豆酯酶比活力(6.585±0.090)U/mg。结论与粗酶的纯度相比,优化后的大孔树脂法纯化黑豆酶工艺的提纯倍数达到6.143倍,为黑豆酯酶的提纯和有机磷农药残留的检测提供了科学依据。     

微量测定木聚糖酶活力的新方法——MBTH法

建立一种木聚糖酶活力的微量测定新方法--3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法。根据木聚糖及其酶解产物的特殊性,研究MBTH法的显色条件,并以多点测定法对酶活力测定中的几个关键参数进行探讨。结果表明：蛋白质在其质量浓度低于30μg/mL时对测定无干扰;木聚糖溶液的最佳测定质量浓度为4mg/mL;较高的酶解温度会使木聚糖酶在测定过程中失活,因此,酶活力测定的最佳温度为30℃,而远低于该酶的最适温度;酶解时间为60min以内;酶解产物与MBTH试剂的反应时间应控制在13～16min之间,以15min为最佳。以酶解时间为30min计,本法检测限为0.135mU/mL,定量限为0.451mU/mL,适当延长酶解时间可相应提高酶活力检测灵敏度。该法准确度高,结果稳定,灵敏度远高于DNS法。