强烈炽热球菌几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组成与结构分析

利用全基因合成方法合成了强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的几丁质酶编码基因并在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现了可溶表达。利用该酶对低脱乙酰度壳聚糖进行水解并对获得的壳寡糖产物进行组成及结构分析。分子排阻高效液相色谱结果显示,水解产物相对分子质量分布范围为1?000～5?000。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度2～9、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振对酶解产物壳寡糖的结构鉴定结果显示,所有寡糖组分的还原端均主要由两个连续的N-乙酰氨基葡萄糖组成。综上,本研究利用来源于强烈炽热球菌的几丁质酶制备了还原末端结构确定的低脱乙酰度壳寡糖,为复杂结构壳寡糖结构与功能关系研究提供了理论支持。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性

研究枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因（BsCsn46）在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的高效表达、重组酶性质及其酶解特性。重组菌在5 L发酵罐高密度发酵后胞外酶活力高达50 370 U/mL,蛋白质量浓度15.7 mg/mL。粗酶经强阴离子交换层析纯化,纯酶比活力为4 065.7 U/mg,最适pH 6.0,最适温度55 ℃,在45 ℃以下保持稳定。该酶水解3 g/100 mL壳聚糖得到主产物为二糖、三糖和四糖的壳寡糖,水解率为92.8%,壳寡糖得率为90.9%。本研究的重组壳聚糖酶产酶水平和水解效率高,为工业化制备壳聚糖酶及大规模制备壳寡糖的应用提供了理论支持。     

蒸汽爆破预处理联合壳聚糖酶制备壳三糖

为解除壳聚糖底物的不溶解性对壳聚糖酶的限制,并实现单一聚合度壳寡糖的绿色制备,该研究对壳聚糖进行蒸汽爆破预处理,随后使用在枯草芽孢杆菌WB800中高效表达的壳聚糖酶Csn-But进行酶解。扫描电镜结果显示,经过2.4 MPa蒸汽爆破处理的壳聚糖显示多刺的纤维状细枝排列,且表面被明显撕裂,分离和暴露的纤维中含有多个空腔。傅里叶变换衰减全反射红外光谱结果显示蒸汽爆破处理后壳聚糖的化学键未被破坏,氢键网络被破坏。使用壳聚糖酶Csn-But酶解在2.4 MPa蒸汽爆破压力下处理的壳聚糖48 h后,壳寡糖含量较未预处理对照组提高5.4倍,产物浓度达到2.0 mg/mL。并通过调控底物浓度,在作用6%浓度的底物时,实现了高纯度壳三糖的制备。     

萎缩芽孢杆菌Rk1壳聚糖酶高效制备及特性表征

壳聚糖酶在壳寡糖酶法制备过程中发挥重要作用,高效制备壳聚糖酶为其产业化应用奠定基础。采用同源克隆获得萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)Rk1壳聚糖酶基因(bacsn46)。将密码子优化和分子伴侣蛋白共表达进行结合,实现萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶(BaCsn46)高效表达。通过表征分析获得重组BaCsn46酶学特性。bacsn46基因全长825个碱基,编码274个氨基酸,其中前32个氨基酸为信号肽序列。在7 L发酵罐条件下,重组菌最高发酵酶活力和总蛋白质量浓度分别达到7 356 U/mL和5.95 g/L。重组BaCsn46最适反应温度和pH分别是60℃和6.0,金属离子Mg²⁺和Mn²⁺对重组BaCsn46具有激活作用,重组BaCsn46最小和最适水解底物分别是壳四糖和95%脱乙酰度胶体壳聚糖。此外重组BaCsn46能够高效水解不同浓度胶体壳聚糖,制备不同聚合度壳寡糖。     

南极磷虾壳聚糖、壳寡糖的制备与品质鉴定

本研究以南极磷虾壳为原料,制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,并对二者的品质进行鉴定。南极磷虾壳经脱钙、脱蛋白处理,探索脱乙酰反应条件（碱溶液浓度、反应温度与反应时间）,制备具有较高脱乙酰度的南极磷虾壳聚糖,并对壳聚糖的理化指标进行鉴定;探索酶法降解条件（壳聚糖酶添加量、酶解时间）,制备较高纯度的南极磷虾壳寡糖,并对壳寡糖的结构特征进行鉴定。结果表明,使用60%的氢氧化钠于110 ℃脱乙酰处理4 h制备的南极磷虾壳聚糖脱乙酰度为85.74%,粘均分子量为 305.65 kDa,水分含量4.66%,灰分含量0.98%,酸不溶物含量0.40%,各项理化指标均符合食品级壳聚糖的要求;使用壳聚糖酶水解南极磷虾壳聚糖制备壳寡糖,在壳聚糖酶添加量为0.2% （m/V）,酶解16 h条件下,南极磷虾壳寡糖产品得率为46.0%,红外光谱与NMR谱图显示了表征壳寡糖结构的全部特征峰,质谱结果显示南极磷虾壳寡糖主要由二糖(GlcN)₂、三糖(GlcN)₂-GlcNAc与四糖(GlcN)₃-GlcNAc构成。本研究通过制备较高品质的壳聚糖与壳寡糖,为南极磷虾壳的高值综合利用与南极磷虾新产品开发提供了技术支持。     

响应面法优化组成型壳聚糖酶酶解条件

以壳聚糖为原料,通过蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）发酵所得壳聚糖酶水解壳聚糖产生壳寡糖,对酶解pH、温度、底物浓度和时间分别进行单因素试验,并在此基础上,通过响应面法研究这4种因素对壳寡糖产量的影响,优化酶解条件。结果表明,壳聚糖酶酶解的最佳条件为pH值5.6,酶解温度53 ℃,壳聚糖质量分数2.09%,酶解时间157 min。在该优化条件下,壳寡糖的浓度为35.73 μmol/mL,与模型预测值35.476 μmol/mL接近,则该模型可用于优化壳聚糖酶酶解条件。     

耐盐芽孢杆菌R1高效壳聚糖酶异源表达及特性分析

采用同源克隆获得耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶基因,并异源表达制备重组耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶（CsnBh46）,通过表征分析获得重组CsnBh46酶学特性。重组CsnBh46全长278个氨基酸,三维结构显示其分为上下两个半球,包含9个α螺旋和2个β折叠。在7 L发酵罐中,重组工程菌bh-5的最高酶活力和总蛋白质质量浓度分别为6 375 U/mL和4.3 g/L。纯化后的重组CsnBh46最适反应pH和温度分别为6.0和60 ℃,金属离子Mn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺对重组CsnBh46具有激活作用。重组CsnBh46最适底物为脱乙酰度95%胶体壳聚糖。重组CsnBh46能够高效水解胶体壳聚糖并且根据反应时间可以定向制备不同聚合度壳寡糖。本研究为CsnBh46产业化应用奠定基础。     

壳聚糖酶解产物的功能研究

为了了解壳聚糖酶解产物的组分及功能,利用蜡状芽孢杆菌发酵所得到的壳聚糖酶,经盐析,透析,蛋白质纯化等步骤精制后所得酶液,对壳聚糖商品进行酶解,进而利用液质联用分析壳聚糖酶解产物的组分,并对酶解产物抗氧化的能力,以及螯合重金属的功能进行了研究。发现利用酶法降解壳聚糖所得的酶解产物中的组分分为4部分,分别为N-乙酰氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖、壳四糖,除N-乙酰氨基葡萄糖外,其余均为低聚合度(2～4)的壳寡糖。壳寡糖具有抗氧化的能力,且浓度越高,抗氧化的效果越显著。壳寡糖具有螯合Zn~(2+)和Cu~(2+)的能力,主要是通过分子内的羟基、氨基和乙酰氨基三个活性官能团与Zn~(2+)和Cu~(2+)发生配位反应。     

组成型壳聚糖酶制备壳寡糖酶解条件的优化

主要对组成型壳聚糖酶降解壳聚糖制备低壳寡糖的工艺进行了研究。以酶解产物壳寡糖的产量(mg)为指标,酶解pH、酶解温度(℃)、底物浓度(%)、酶解时间(min)为自变量,在单因素试验的基础上,通过正交实验确定了最佳酶解工艺为:酶解pH 7.0、酶解温度50℃、酶解时间90 min、底物浓度1%,此时壳寡糖产含量为5.476 mg。     

纤维素酶制备低脱乙酰度壳寡糖及其组成分析

使用具有壳聚糖水解活性商品纤维素酶对制备的低脱乙酰度壳聚糖进行水解,进而对产物的组成及结构进行分析。分子排阻高效液相色谱(Size exclusion high performance liquid chromatography,SE-HPLC)结果显示,水解产物主要为相对分子质量1000~5000的低聚合度壳聚糖及壳寡糖。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)可对水解物中小分子组分进行有效分离及鉴定,根据一级质谱信息,推测其中含有N-乙酰氨基葡萄糖及17种不同结构的壳寡糖。使用核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)对其进行分析,结果显示,产物壳寡糖的还原端主要为N-乙酰氨基葡萄糖,非还原端基本为氨基葡萄糖。综合上述测定结果,推测纤维素酶中发挥壳聚糖水解作用的主要为几丁质酶。     

Production of high degree polymerized chitooligosaccharides in a membrane reactor using purified chitosanase from Bacillus cereus

Crude chitosanase from Bacillus cereus NTU-FC-4 was separated by a cation exchanger to three fractions named CBCI, CBCII, and CBCIII. The CBCI hydrolyzed chitosan to yield dimers. The primary hydrolytic products of CBCII were low degree polymerized (DP) chitooligosaccharides. The CBCIII had the fastest reaction rate and yielded high DP chitooligosaccharides (heptamer and higher DP oligomers). When CBCIII was used in the ultrafiltration membrane reactor with enzyme/substrate ratio 0.06 unit/mg and 100 min of residence time (RT), the concentration of high DP oligomers was 9.78 mg/mL which occupied ca. 48% of total oligomers in the final product as compared to ca. 29% resulted from the crude enzyme. Decrease of RT to 50 min and 33 min, the high DP oligomers in the products were ca. 61% and 69%, respectively. This system could be operated for at least 24 h and kept a constant permeate flux and product output rate.     

Process Characteristics of Hydrolysis of Chitosan in a Continuous Enzymatic Membrane Reactor

ABSTRACT: Crude enzyme from Bacillus cereus NTU-FC-4 was used to hydrolyze chitosan of 66% deacetylation in a membrane reactor, operated at 45 °C and pH 5, to continuously produce chitooligosaccharides. Major oligomers in the product from the reactor were chitobiose, chitotriose, chitotetraose, chitopentaose, and chitohexaose. When the membrane reactor was operated at an enzyme/substrate ratio of 0.2 (unit/mg) and residence time of 100 min, it reached steady state in 2.5 h. The system could be operated for 15 h and still maintained a stable product composition. When the volume replacement exceeded 2.5, the productivity of the membrane reactor became higher than that of the batch reactor, and the difference between them became even greater when the volume replacement was further increased. The apparent Michaelis constant (K_m) for the enzyme in the membrane reactor was 18.8 mg/mL, but the apparent K_m was 5.4 mg/mL for the batch reactor, suggesting that the affinity of the enzyme for chitosan was lower in the membrane reactor compared with the enzyme in the batch reactor. The estimated values of apparent V_max were 0.18 and 0.20 mg reducing sugar/mL/min for the enzyme in the membrane reactor and in the batch reactor, respectively, indicating that the enzyme activity was not greatly altered when used in the membrane reactor.     

高浓度壳聚糖溶液酶解条件优化

在研究了壳聚糖酶的温度和pH稳定性的基础上,通过在溶解过程中加酶对高浓度壳聚糖溶液酶解条件进行优化,考查了加酶时间及加酶量对8%壳聚糖溶液酶解效率和酶解液粘度的影响,并对优化前后目标溶液中几种壳寡糖的含量进行分析。结果表明:壳聚糖酶在45~55℃及pH4.5~5.5范围内保持稳定;对8%壳聚糖溶液体系,在滴加盐酸浓度达到0.17 mol/L时,加入2 U/g壳聚糖的酶液,当盐酸浓度达到0.48 mol/L时再补加3 U/g壳聚糖的酶液,这种方案可以有效降低体系粘度并保持酶活力;薄层色谱和高效液相色谱分析结果表明,通过以上方式的优化,聚合度2~6的壳寡糖总含量及壳五糖和壳六糖的含量均显著增加(p<0.05),分别达到42.7、5.5和3.9 mg/mL,大大提高了生产效率和降低浓缩成本。     

泥鳅肉酶解物对羟自由基的清除作用

为了探讨深度开发泥鳅蛋白制备功能性肽的可能性,采用比色法研究泥鳅肉酶解物对Fenton 体系产生的羟自由基的清除效果,从复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶5 种酶中,筛选出菠萝蛋白酶作为酶解泥鳅肉制备具有清除羟自由基活性酶解物的适宜水解酶。用响应面分析法(RSM)对该酶的酶解条件进行优化,并采用Sephadex G-15 凝胶层析测定最佳酶解条件下制得的酶解液中活性肽的相对分子质量分布。结果表明,菠萝蛋白酶的最佳酶解条件为：固液比1:4、加酶量0.2%、pH6.47、温度54.48℃、酶解时间59.97min,酶解物对羟自由基的清除率为99.03 %,IC50 值为0.57mg/mL。酶解液中活性肽的相对分子质量范围为1129～2344。     

响应面法优化微波辅助果胶酶制备壳寡糖的工艺

为优化壳寡糖制备工艺,提高壳寡糖得率,以壳聚糖为原料,采用微波法辅助果胶酶酶解壳聚糖制备壳寡糖,以还原糖含量作为壳寡糖的产率依据,通过单因素实验和响应面实验确定最佳工艺条件为:果胶酶加酶量2100 U/g,微波功率510 W,pH4.4,反应温度50℃,在此工艺条件下获得的降解产物中还原糖浓度为1.964 mg/mL,与单一果胶酶酶解法(1.747 mg/mL)相比提高了12%,与单一微波法(1.671 mg/mL)相比提高了18%。     

黄粉虫幼虫粉酶解及体外抗氧化性研究

主要研究了Alcalase蛋白酶水解脱脂黄粉虫幼虫粉的工艺,并对水解产物的体外抗氧化能力进行测定.在单因素基础上以还原力为指标设计正交试验得到水解最佳条件为:温度60℃,pH值8.5,加酶量150μL,反应时间100 min.抗氧化试验结果表明,脱脂黄粉虫幼虫粉水解液清除1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)自由基和羟自由基的半抑制率(IC_(50))分别为0.45 mg/mL和4.1 mg/mL,分别是VC的IC_(50)值的112.5倍和19.5倍,还原能力是VC的1/100.将水解前后的脱脂黄粉虫幼虫粉溶液进行高效毛细管电泳(HPCE)测定,测定结果表明,经Alcalase蛋白酶水解后,溶液中可溶性组分增多.     

基于超声预处理的脱脂玉米胚芽ACE抑制肽的制备

为了研究超声辅助酶解制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的较优工艺,通过三种超声设备对脱脂玉米胚芽预处理,碱性蛋白酶酶解,酶解液体外模拟胃肠消化,以消化液ACE抑制率和酶解过程中玉米胚芽水解度(DH)为指标对超声预处理和酶解的参数进行单因素逐级优化。实验结果表明,最佳超声工作模式为20~40 kHz聚能式逆流双频交替超声模式;超声工作参数为功率密度120 W/L,超声预处理时间15 min,初始温度30℃,物料浓度5%;酶解条件为加酶量3000 U/g,酶解时间30 min,pH9.0,酶解温度50℃。在此条件下,酶解液的IC₅₀为4.166 mg/mL,比对照组降低了5.08%;胃肠消化液的IC₅₀为3.986 mg/mL,比对照降低了4.44%。制备的酶解产物,经模拟胃肠消化后具有较强的ACE抑制活性。优化获得的制备脱脂玉米胚芽ACE抑制肽的工艺是可行的。