黄曲霉产胞外β-1 ,3-1 ,4-葡聚糖酶的发酵条件优化

研究发现一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的黄曲霉菌株,优化了其产酶条件并考察了粗酶潜在的工业应用价值。依次采用单因素法和响应面分析法优化该菌发酵产酶条件,得到其优化产酶条件:麸皮19 g/L、磷酸氢二铵30g/L、吐温-60 21 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO_4·7H_2O 0. 5 g/L、KH_2PO_40. 75 g/L、培养基初始pH值8. 0、培养温度38℃、培养时间6d。在此条件下,黄曲霉能够分泌的最高胞外β-1, 3-1,4-葡聚糖酶酶活达155.9 U/mL。水解研究发现,该酶能高效降解大麦粉和燕麦粉中的β-葡聚糖,并直接生成葡萄糖。这些结果表明,黄曲霉能高效分泌β-1,3-1,4-葡聚糖酶,且该酶具有较强的工业应用前景。     

泡盛曲霉β-1，3-1，4-葡聚糖酶的纯化、性质及其用于制备β-葡寡糖

作者研究了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶(AaBglu29)的纯化、性质及其水解燕麦麸皮制备葡寡糖。粗酶液采用硫酸铵沉淀、QSFF强阴离子柱和DEAE-52弱阴离子柱层析3步纯化,得到电泳级纯酶,经SDS-PAGE和Sephacryl-100测定的相对分子质量分别为30.7×10~3和27.6×10~3。该酶最适pH为5.0,最适温度为55℃。AaBglu29底物特异性专一,对大麦葡聚糖、燕麦葡聚糖和地衣多糖的比酶活力分别为9 500、7 950 U/mg和5 980 U/mg。该酶水解燕麦麸皮产生葡三糖和葡四糖,经优化,当底物质量分数为5%,加酶量为100 U/g时,于50℃、pH 5.0条件下水解4 h,葡寡糖转化率可达90%。AaBglu29优良的酶学特性使其在食品和饲料工业具有较大的应用潜力。     

泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化

从土壤样品中筛选得到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),命名为Aspergillus awamori CAU33。依次采用单因素试验和响应面分析法优化了其液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件,得到该菌株产酶的最适条件为:玉米芯质量浓度55 g/L、大豆蛋白胨质量浓度25 g/L、曲拉通X-114质量浓度23 g/L、初始pH 4.5、培养温度35℃、培养时间6 d。在此条件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到8 447 U/m L,为优化前的17.6倍。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

工业酿酒酵母重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶部分酶学性质的研究

用刚果红法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力,研究重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表达的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶学性质,并与出发菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达的原始酶的性质进行比较。结果表明,重组酶保持了与原始酶相同的底物专一性。重组酶的最适反应温度为35℃,而原始酶为55℃。重组酶的热稳定性也发生了改变,40℃热处理20min只保留63.4%的最初酶活力,但温度再升高时对热处理敏感度降低,70℃的热处理20min仍保留45.9%的最初酶活力;而原始酶50℃时稳定,60℃以上的热处理酶活力损失很大。与原始酶相比,重组酶的最适pH值下降为pH5.0,而原始酶为pH6.5;相比原始酶在pH7.0有最大稳定性,重组酶在pH5.5时有最大稳定性。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应条件与原始酶相比更接近啤酒的实际生产条件。     

碎囊毛霉产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分离纯化及其酶学性质

基于碎囊毛霉M-28固态发酵方式,采用单因素试验对其所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行提取纯化条件优化,并开展部分酶学性质研究。结果表明:用pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液在200 r/min浸提固态发酵基质30 min,所得粗酶液经饱和度80%硫酸铵盐析、24 h透析浓缩、Sephadex G-100柱层析分离后,经紫外分光光度计检测,得到2个蛋白峰,酶活力测定发现有一个峰具有酶活性,收集该酶活组分并采用聚乙二醇高度吸附浓缩,再用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度检验,纯化酶蛋白呈单一谱带,分子质量约为17.2 kD,酶比活力达到225.02 U/mg,纯度较粗酶液提高了2.48倍。酶的最适反应温度为55℃、在40~50℃时相对稳定,其最适pH值为5.5、酶活力在pH 4.5~5.5条件下相对稳定。Fe3+和Al3+对该酶具有明显抑制作用,Fe2+对其有激活作用,其他金属离子影响不大。     

耐高温β-葡聚糖酶产生菌株的筛选及酶学性质的研究

从云南安宁温泉周围土壤中筛选到1株热稳定性能较好的β-葡聚糖酶产生菌W-9.其发酵条件及酶学特性为:发酵 72h,在pH6.0、70℃条件下,酶活性为82.64u/mL.分子生物学及其生理生化鉴定,该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).W-9产β-葡聚糖酶的酶学性质结果显示,其产β-葡聚糖酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为70℃,在70℃条件下保温时,酶活基本稳定.     

马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶合成条件的优化及其酶学性质表征

β-半乳糖苷酶是广泛使用的食品添加剂,主要用于降解乳制品中的乳糖,缓解乳糖不耐受症状。该研究对实验室保藏菌株马克斯克鲁维酵母的发酵条件进行了优化。在20 g/L半乳糖、20 g/L玉米浆干粉、40℃、初始pH 6.5、150 r/min的条件下,粗酶液的酶活力为26.3 U/mL,表明该菌株具有利用廉价碳氮源高效生产β-半乳糖苷酶的潜力。通过DEAE阴离子交换层析进一步纯化得到比活力为124.09 U/mg的纯化酶。纯化后酶的最适温度40℃,最适pH 6,K_m为5.28 mmol/L,k_cat为4.74 s^-1。此外,发现该酶受Mg²⁺的促进,在20～40℃表现出优异的热稳定性,40℃下30 min仍能保持95.6%的活力。因此,马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶比乳酸克鲁维酵母的热稳定性更好,具有潜在的工业应用潜力。     

产β-葡萄糖苷酶酵母菌的分离鉴定及酶学特性

在葡萄酒自然发酵的初期,非酿酒酵母菌占主导地位,其产生的β-葡萄糖苷酶独特的水解活性,能够赋予葡萄酒特殊的香气。在新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中,通过对非酿酒酵母菌的采集与筛选,得到1株产β-葡萄糖苷酶能力较强的菌株;紫外-微波复合诱变后,酶活力增加1.81倍;经26S r RNA基因序列分析,鉴定为克鲁维毕赤酵母,并命名为XYN086(P.kluyveri XYN086);酶学性质研究表明:该菌株所产β-葡萄糖苷酶最适pH为6.0,在pH 6.0~8.0时酶活力保持60%以上;酶的最适作用温度为60℃,在60℃酶活力保持较好;金属离子依赖性实验表明,Fe2+和Cu2+对该菌株所产β-葡萄糖苷酶的酶活力均有激活作用,Mg2+、Ca2+、K+和Na+均有抑制作用,说明此菌株所产的β-葡萄糖苷酶对金属离子具有依赖性。据以上数据确认,该菌株为产β-葡萄糖苷酶克鲁维毕赤酵母。     

β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研究

从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,其中DK3菌株的摇瓶培养液的酶活力达3.85U/mL。该酶水解葡甘露聚糖的最适温度为37℃,最适pH为6.0,pH稳定范围为5.0～9.0,在低于40℃的温度下基本稳定。Fe2+、Cu2+、EDTA和NH4+对该酶有抑制作用,Na+则有激活作用。     

壳聚糖/海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的研究

以壳聚糖、海藻酸钠为包埋材料,戊二醛为交联剂,固定化β-葡萄糖苷酶,研究了固定化条件与固定化酶的活力回收的关系.通过单因素和正交实验确定了最佳的固定化方法,即:壳聚糖(脱乙酰度=85%)浓度为1.5%、海藻酸钠浓度为2%、戊二醛浓度为1.0%、钙离子浓度为0.7mol/L、pH为5,固定化酶的活力回收达到83.8%.固定化酶的最适温度为60℃,最适pH为5,该固定化酶重复使用5次后,其活力仍能保持70%.由于β-葡萄糖苷酶比较昂贵,采用固定化技术将其固定在载体上反复使用,可以达到简化工艺、降低成本的目的,作用于大豆异黄酮的水解方面具有潜在的应用前景.     

里氏木霉β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的工艺研究

研究了里氏木霉β-葡萄糖苷酶的酶学性质,及其水解大豆异黄酮糖苷能力.该酶反应的最适温度为50℃,最佳pH为5.0;此酶在pH 4.5～5.5之间和低于60℃下酶较稳定,在80℃基本无活力.采用里氏木霉β-葡萄糖苷酶水解的方法,将大豆异黄酮糖苷转化为苷元,以染料木苷水解率为检测指标.通过正交试验确定了该酶水解大豆异黄酮的工艺条件为反应温度50℃、水解时间90 min、水解介质pH4.5、加酶量20U,大豆异黄酮中染料木苷的水解率为99%.     

嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶在枯草杆菌中的表达及酶学性质

首先根据Thermopolyspora flexuosa的内切-1,4-β-木聚糖酶基因设计了引物,PCR扩增成功后进行酶切消化,连接载体质粒pHT43,经大肠杆菌DH5α扩增后,挑选阳性克隆,经菌体PCR及测序验证后,将基因序列测序正确的质粒大量抽提,经过转化导入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilius WB800N宿主,培养并经过1 mmol/L IPTG诱导表达后,发酵胞外上清经SDS-PAGE电泳证明重组蛋白质成功获得表达。其相对分子质量为27 kD,最适反应温度为80℃,最适反应pH为6.0。由此得知,分泌表达的嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌株构建成功,这为未来该酶的产业化生产奠定了基础。     

β-葡聚糖酶降解玉米秸秆中β-葡聚糖的工艺

利用β-葡聚糖酶降解玉米秸秆中的β-葡聚糖,确定了酶浓度、pH、酶解时间以及温度等因素,并通过正交实验进行了优化.影响因素为:酶浓度>pH>反应温度>反应时间.酶解的最适条件:酶活25.86万U/g,pH值4.5,反应时间15 h,反应温度45℃.玉米秸秆的β-葡聚糖的降解率为41.96%.     

酿酒酵母表面展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质研究

固定化酶是酵母表面展示技术的1个重要应用方向。本文应用食品级酵母展示表达系统进行表达,成功获得具有生物活性且固定在酿酒酵母细胞表面的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并测定其酶学性质。结果表明,与分泌表达的自由酶相比,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生了改变。其最适温度为60℃,热稳定性增强。50℃保温3 h,对酶活几乎没有影响。60℃保温1 h后的酶活为初始酶活的129.2%。随着该温度下保温时间的延长,酶活迅速下降,保温3h后的酶活为初始酶活的64.6%。70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%;1 h后酶活开始下降;70℃保温3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4~7范围内酶的稳定性较好。     

木聚糖酶产生菌Gh-5培养基配方及发酵条件的优化

研究培养基组分与发酵工艺条件对试验菌株Gh-5产木聚糖酶的发酵影响,并对木聚糖酶的酶学性质进行初步研究。结果表明,该菌最适发酵产酶培养基组分为甘露糖15 g/L,氯化铵10 g/L,ZnSO4 0.3 g/L,KH2PO4 0.5 g/L;最适发酵条件为温度37 ℃;pH值为8.0;接种量14 %;发酵培养生长周期36 h。木聚糖酶产生菌株Gh-5发酵优化后的酶活力为114.64 U/mL,较优化前38.02 U/mL提高了201.53%。木聚糖酶酶学性质研究结果表明,木聚糖酶酶活最适pH值为8.0;最适温度为65 ℃;Zn2+对木聚糖酶酶活有较好促进作用。     

从长白山阔叶林中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌及其酶学性质研究

利用马丁氏培养基富集、PDA培养基纯化和七叶灵培养基显色,从长白山阔叶林中初步筛选出6株产β-葡萄糖苷酶的真菌。对真菌发酵生成的β-葡萄糖苷酶进行提取和纯化,测得10号菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高为18.34 U/mL,形态学和分子学结合方法鉴定该菌株为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。该菌株所产β-葡萄糖苷酶最适反应温度约为55℃,在温度30、40℃和50℃时较为稳定。最适反应pH值约为5,在pH值为5~6之间相对较稳定。Cu~(2+)对酶活力有较强的抑制作用,而Ag~+有较强的激活作用。     

广东客家娘酒发酵过程中产β-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选及酶学性质研究

采用七叶苷分离培养基初筛、4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPGal）显色法复筛的方法从广东客家娘酒发酵过程中的酒糟中筛选产β-葡萄糖苷酶能力较强的酵母菌,通过26S rDNA D1/D2区基因序列分析对其进行鉴定,并对其酶学性质进行分析。结果表明,获得1株产β-葡萄糖苷酶能力较强的假丝酵母Candida apicola kj_312。该菌株所产的β-葡萄糖苷酶具有较宽的底物特异性,最适底物为对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷;最适反应温度为60 ℃,在25～65 ℃范围内,相对酶活力＞50%;最适pH值为4.5,在pH值为4.0～7.0酸性范围内,相对酶活力＞80%;1 mmol/L的Ca2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+及100 mmol/L的Ca2+、Zn2+和Fe2+能显著提高酶活力。     

常压室温等离子体诱变选育木聚糖酶高产菌及其酶学性质研究

利用常压室温等离子体（ARTP）技术对黑曲霉（Aspergillus niger）FXY进行诱变处理,并对菌株的遗传稳定性及所产木聚糖酶的酶学性质进行了研究。结果表明,筛得一株高产木聚糖酶且能稳定遗传的菌株ARTP-82,其所产木聚糖酶酶活为175.33 U/mL,较出发菌株提高了120.8%。酶活的提高与酶比活力增加有关、与菌株生物量增加无关;该木聚糖酶的最适温度为45.0 ℃、最适pH值为7.0,在该温度和pH值条件下酶的稳定性良好。     

黑曲霉M_1菌株木聚糖酶复合酶的固态发酵条件及其酶学性质研究

以玉米芯和麸皮 ( 7∶3 )为碳源 ,(NH4) 2 SO4( 2 % )为氮源 ,3 0℃培养 72h ,发酵曲用蒸馏水3 0℃浸提 1h ,得到 β 1,4 木聚糖酶活力高 ,β 木糖苷酶活力低的粗酶液。β 1,4 木聚糖酶和 β 木糖苷酶的最适作用温度分别为 5 0℃和 60℃ ,最适作用pH分别为 4 8和 4 0 ,β 1,4 木聚糖酶在pH5 0～ 10 6范围内稳定 ,β 木糖苷酶在 pH 3 0～ 3 0范围内稳定。β 木糖苷酶的热稳定性比 β 1,4 木聚糖酶高