多重RT-PCR法检测燕窝及其制品掺伪成分

目的建立一种食用燕窝中主成分及掺伪成分的双重和三重实时荧光PCR检测方法。方法本研究通过合成金丝燕成分、银耳成分、红藻成分特异性的引物和探针,建立燕窝中主成分及掺伪成分的双重和三重实时荧光PCR检测体系,并设计相应的特异性实验保证检测体系的准确性,最后使用所建立的方法对市售样品进行检测并收集数据,验证多重实时荧光PCR检测方法的适用性。结果本方法可在1 d内完成样品的检测,建立的体系对金丝燕成分、银耳成分的检测灵敏度为0.1 ng/μL,红藻成分的检测灵敏度为0.5 ng/μL;燕窝中掺入银耳的检测限可达到0.1%;燕窝中掺入石花菜的检测限可达到0.5%。结论本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法具有准确、灵敏度高、特异性好的优点,可用于燕窝及其制品中掺假物成分的准确定性检测。     

实时荧光PCR在虹鳟源性成分鉴别中的应用

为鉴别食品中虹鳟源性成分,以线粒体ATP6 基因为靶点,设计虹鳟特异性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的引物、探针,利用实时荧光聚合酶链式反应（real-time fluorescent PCR,RT-PCR）技术,建立针对虹鳟源性成分的实时荧光PCR 快速检测方法;选取17 种市场上常见鱼类进行试验,结果均无扩增反应,同时通过DNA灵敏度试验,表明该研究建立的鉴别方法DNA 浓度灵敏度能达到0.1 ng/μL,且特异性良好。同时,利用该方法对市售的22 种商品三文鱼及其制品进行检测,结果显示10 种商品中含有虹鳟（Oncorhynchus mykiss）成分。该研究所建立的检测方法可用于对市售产品中虹鳟源性成分的鉴别,同时也表明虹鳟是市售三文鱼的主要鱼种之一。     

应用PCR技术检测掺假肉类

目的建立5种动物源性成分的普通PCR检测方法,4种动物源性成分的实时荧光PCR检测方法,为食品安全服务。方法提取各肉制品的基因组DNA,合成PCR检测引物和荧光探针,优化反应条件和反应体系建立各动物源性成分的检测方法,分析市场上肉类掺假状况。结果建立了几种动物源性成分的检测方法,根据已建方法对保定辖区采集的样品进行检测,羊肉制品56份,掺假率为75%;驴肉制品15份,掺假率为6.7%;牛肉制品5份,掺假率为20%;兔肉制品2份,掺假1份。这些结果表明辖区市场上存在较多的肉类掺假问题,尤其是来自自由市场和烧烤摊的样品,掺假现象严重损坏了消费者的权益。结论建立的PCR检测方法获取DNA快速,检测灵敏度可以达到pg或fg级别,适用于大量肉制品的检测。     

食用淀粉及其制品中植物源性成分检测方法的建立

目的 建立一种含有内源质控的五重实时荧光聚合酶链反应(pPolymerase chain reaction, PCR)技术,用以快速鉴别淀粉及其制品中豌豆源性、绿豆源性、木薯源性、玉米源性成分。方法 首先设计豌豆、绿豆、木薯、玉米的特异性引物、探针,建立多重实时荧光PCR检测方法,再验证方法的特异性和绝对灵敏度,最后通过样品掺假模拟试验验证方法的检出限。 结果 该方法的特异性强,仅能检出豌豆源性、绿豆源性、木薯源性、玉米源性成分;灵敏度较高,对玉米源性和木薯源性的检测灵敏度可达到1×10-1 ng/μL水平,豌豆源性和绿豆源性的检测灵敏度可达到1×10-2 ng/μL水平。结论 本研究建立的五重实时荧光PCR方法可用来区分市场上淀粉及其制品中的豌豆源性、绿豆源性、玉米源性和木薯源性成分,具有较好的应用价值 。     

玛卡及其制品的PCR方法鉴别研究

本研究通过玛卡的defensin基因序列,设计了玛卡的特异性引物,建立了玛卡及其制品中玛卡源性成分检测的一种新方法。通过物种特异性测试,所设计的引物能够特异性扩增玛卡基因,并且,DNA浓度的检测灵敏度达到0.1 ng/μL以上,重量灵敏度达到0.1%以上。并结合芜菁源性成分基因检测方法对市场随机抽取的21份玛卡及其制品进行检测,21份样品均检出了玛卡源性成分而未检出芜菁源性成分。本研究所建立的PCR检测方法快速,准确,高效,适用于市场上玛卡及其制品真伪的快速鉴别。      

玛卡及其制品的PCR方法鉴别研究

本研究通过玛卡的defensin基因序列,设计了玛卡的特异性引物,建立了玛卡及其制品中玛卡源性成分检测的一种新方法。通过物种特异性测试,所设计的引物能够特异性扩增玛卡基因,并且,DNA浓度的检测灵敏度达到0.1 ng/μL以上,重量灵敏度达到0.1%以上。并结合芜菁源性成分基因检测方法对市场随机抽取的21份玛卡及其制品进行检测,21份样品均检出了玛卡源性成分而未检出芜菁源性成分。本研究所建立的PCR检测方法快速,准确,高效,适用于市场上玛卡及其制品真伪的快速鉴别。     

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猪源性成分

针对猪线粒体细胞色素b基因序列设计特异的引物和探针,建立食品中猪源性成分实时荧光聚合酶链式反应检测方法,并经特异性和敏感性试验验证其可行性。结果表明：该体系可扩增猪肉DNA片段,长度为98bp,其他常见畜、禽肉成分均无法正常扩增。该体系灵敏度低至1pg,且阴性样品扩增后的Ct值限制在35循环以后。对于各模拟肉类样品中掺杂的猪源性成分,其检测限均达1%,经市售加工食品检测验证,表明所建立的猪引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速、高效等优点,可用于对食品中猪源性成分的掺假鉴别检测。     

转基因玉米GA21品系LAMP检测引物的筛选及方法的建立

根据转基因玉米GA21品系的特异序列设计了3套环介导等温扩增(LAMP)引物。通过反应温度优化、特异性测定,筛选到1套特异性好的LAMP引物,包括内引物、外引物和环引物各1对。在LAMP反应体系中加入SYBR Green I荧光染料,在实时荧光定量PCR仪上进行实时监测,对筛选到的LAMP引物进行反应条件、反应体系的优化,建立了转基因玉米GA21品系LAMP检测方法。对该方法的特异性、灵敏度、稳定性进行评价,结果表明建立的LAMP检测方法能特异、灵敏、稳定地检测转基因玉米GA21品系,检测限达到0.05%。将建立的LAMP检测方法应用于玉米及其制品中GA21品系的检测,检测结果与实时荧光PCR法的结果完全一致。     

基于LAMP法快速检测羊肉及其制品中的猪、鸭和羊源性成分

目的建立肉制品中猪、鸭和羊源性成分的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,对市售羊肉片、羊肉卷、羊肉串进行猪、鸭和羊源性成分检测分析。方法针对猪、鸭和羊线粒体Cytb基因分别设计2条外引物、2条内引物和2条环引物,优化LAMP反应条件,对猪、鸭和羊源性成分进行特异性和灵敏度试验,对羊肉制品进行上述动物源性成分监测。结果在0.2μmol/L外引物(F3和B3)、1.6μmol/L内引物(FIP和BIP)、0.8μmol/L环引物(FLP和BLP)、1 mol/L甜菜碱、6 mmol/L Mg SO4、1.6 mmol/L d NTP等参数的优化条件下,LAMP法对肉制品中猪、鸭和羊源性成分的检测灵敏度达0.5%。SYTO-9荧光染料的荧光实时检测结果与SYBR Green I染料肉眼观察结果一致。调查发现,该批市售羊肉及制品中存在掺假现象,掺假率为34.5%。结论 LAMP法具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测结果准确的特点,能有效地对肉制品中的猪、鸭和羊源性成分进行检测,可作为羊肉制品掺假的一种快速检测方法。     

实时荧光PCR技术快速检测莲蓉制品中芸豆成分

目的:建立基于实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测莲蓉制品中芸豆成分的方法。方法:以芸豆pvsbe2基因高度保守区域设计特异性引物和探针,通过对莲子及其他富含淀粉类植物DNA进行扩增,以验证方法的特异性;以1 ng/μL的芸豆DNA进行系列稀释,确定此法检测灵敏度;对含有1%芸豆与莲子的混合样品的DNA模板进行10倍梯度稀释,确定重量检测灵敏度;并应用此方法和PCR方法对市场样品进行了检测,对建立的荧光PCR方法进行验证。结果:该检测方法具有高度特异性,与莲子及其他高淀粉植物无交叉反应;DNA质量浓度的检测灵敏度达到1 pg/μL,重量检测灵敏度可达0.01%。含芸豆成分的莲蓉月饼扩增阳性,检测结果与食品标签相符。结论:本研究建立的实时荧光PCR方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便的特点,更适合莲蓉制品中芸豆成分的快速检测。     

可视化跨越式滚环等温扩增技术在猪肉掺假检测中的应用

目的:建立了一种跨越式等温扩增技术(SRCA)结合荧光染料SYBR Green I检测肉制品中猪肉掺假的方法。方法:根据NCBI中猪的线粒体序列,通过DNAMAN等软件设计SRCA的特异性引物,分别采用普通SRCA和荧光可视化SRCA的方法建立肉制品中猪肉成分的检测方法,对9个不同物种的新鲜肌肉组织样本进行实验从而验证SRCA方法的特异性,并对66份未标识猪肉成分商业肉制品进行猪肉成分的检测。结果:SRCA荧光可视法检测猪肉DNA的灵敏度为6.5 fg/μL,与传统PCR方法相比,SRCA荧光可视法的灵敏度提高了1000倍。在人工添加猪肉的混合样品中,SRCA方法检测猪肉含量为0.01%(w/w)。与NY/T 3309-2018行业标准相比,SRCA方法检测肉制品中猪肉的敏感性、特异性和符合率分别为100%、96.66%、98.48%。结论:SRCA是一种检测肉制品中猪肉掺假的灵敏、直观的方法,具有很大的应用潜力。     

PCR法检测鱼及其制品中的鱼源性成分

目的:建立一种快速、特异、灵敏的鱼源性成分聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法:根据鱼线粒体基因组12S r RNA中的保守序列设计鱼源性特异性引物,进行PCR扩增,建立鱼源性成分检测方法;对24种鱼及鸡、牛、羊、猪、鸭、虾6种常见的易混于鱼制品的动物源性成分进行特异性检测;将草鱼肉混入其他动物肉中,混合均匀后提取DNA进行PCR扩增,确定肉样水平的检测灵敏度;将草鱼DNA混入其他动物DNA中,以混合后的DNA为模板进行PCR扩增,确定DNA水平的检测灵敏度。结果:该方法能特异性的对鱼源性成分进行快速检测,检测灵敏度达0.5%。结论:该方法能对食品中是否含有鱼源性成分进行初筛,到达快速检测的目的,对防止食品掺假、维护消费者利益、规范市场秩序有重要意义。     

SB/T 10923—2012掺假肉类DNA检测方法的改进与评价

目的 我们对SB/T 10923—2012《肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法》检测方法进行改进,评价其应用于掺假肉DNA鉴定的价值。方法 评价改进后方法的特异性和掺假比例检测能力,并用7份预包装生鲜冷冻肉制品考察实际检验效能。结果 改进后的方法在Cq阈值为30时,能够有效区分20 ng/反应的特异模板,最低可检出0.5%（w/w）的掺假比例。对7份样品共进行24个肉源成分检测,与标签符合率为95.8%（23/24）。有1种鸭源性成分未检出,可能和混样不均匀有关。结论 改进后的方法可快速、特异、简便地用于掺假肉常规检测。     

GNM C7-8实时荧光PCR系统对掺假肉制品中多种动物源性成分的同时检测

应用GNM C7-8实时荧光PCR系统,同时快速检测掺假肉制品中多种动物源性成分。将牛肉粉、驴肉粉、鸵鸟肉粉和羊肉粉4组不同肉粉中分别混入猪肉粉、鸭肉粉、马肉粉、鸡肉粉和狐狸肉粉中的2~3种肉粉,制备人工模拟掺假肉制品。通过GNM C7-8实时荧光PCR和ABI7500荧光PCR方法,对上述四种掺假肉制品进行多种动物源性成分检测和比较。结果表明,GNM C7-8实时荧光PCR方法与ABI7500荧光PCR方法从掺假肉制品中检测猪、鸭、马、鸡和狐狸5种成分的循环数一致,分别是31、31、29、32和25,但基于八模块设计的GNM C7-8实时荧光PCR方法能同时检测四种掺假肉制品中不同动物源性成分,检测时间更短。因此,GNM C7-8实时荧光PCR系统的八个模块能够独立运行,互不干扰,无交叉污染,能够实现对掺假肉制品中多种动物源性成分的同时快速检测,为肉制品掺假检测提供强有力的方法支持。     

实时荧光PCR法快速检测肉类中貉源性成分

目的建立貉源性成分的实时荧光PCR快速检测手段。方法根据貉的线粒体Cytb基因序列设计引物和探针,通过优化扩增反应体系进行实时荧光PCR(RT-PCR)扩增,产物进行快速检测。结果此方法特异性良好,灵敏度可达到10~(-4)ng貉源性DNA的量。在混合或纯肉样品以及常见的肉制品中均可检测。结论本方法可以满足实际工作中肉类掺假检测的要求。     

实时荧光PCR法检测奶制品中常见谷物成分

建立Taqman实时荧光PCR法对奶制品中掺加物大米、玉米、小麦、高粱、大麦等谷物源性成分的初筛检测体系。方法 以常见掺加物大米、玉米、小麦、高粱、大麦等谷物的叶绿体rbcL基因作为靶基因,通过BLAST软件比对,选择其同源保守区域设计引物和探针。经通用性、特异性、灵敏性试验对探针和引物可行性进行验证,并通过模拟含谷物奶粉及市售奶类制品检测对其实际检测能力进行验证。结果 所建立体系可扩增大米、玉米、小麦、高粱、大麦等常见的谷物掺加物的DNA提取物,与市售奶制品的主成分牛奶、羊奶以及其常见添加物香蕉、红枣、菠萝、草莓、西红柿、花生、大豆等动植物源性成分无交叉扩增(Ct＞35)。对小麦纯DNA提取物检出限为0.01ng。对分别掺加5种谷物成分的模拟奶制品检出限均可达0.5%,对市售的14份奶类食品中的谷类成分的检测结果均与食品标签相符。结论 本研究建立的Taqman实时荧光PCR体系具有通用、相对特异、灵敏、实用等优点,可用于奶制品中掺加或掺杂掺假谷物源性成分的快速定性检测。     

基于便携式荧光定量PCR仪定量检测驴肉中掺假鸭肉

为建立快速方便的驴肉制品分子鉴定方法,本文以驴肉和常见的掺假肉类(鸭肉)为研究对象,筛选特异性引物和TaqMan探针,利用便携式Mini8 Plus实时荧光定量PCR仪进行灵敏度和特异性实验,通过绘制扩增标准曲线及确定驴肉和鸭肉的质量与DNA比值常数,对不同掺入比例(加入定量的鸭肉制成含量分别为20%、40%、60%、80%)的模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法对驴、鸭肉均具有良好的特异性,可以与马、猪、山羊、梅花鹿、牛、鸡、狗肉明显区分;对驴源性DNA成分的检出限为0.01 ng/μL,鸭源性DNA成分的检出限为0.1 ng/μL,对驴肉与鸭肉混合物中鸭肉成分的灵敏度为0.1%(w/w);所建立的标准曲线线性关系良好,驴肉DNA扩增标准曲线:y=-3.584x+27.003,R²=0.9982;鸭肉DNA扩增标准曲线:y=-3.538x+30.907,R²=0.9991;采用已建立的方法对35份驴肉样本进行市场试点调查,发现6份(17.1%)驴肉样本中含有鸭肉成分。以上研究结果说明,该实时荧光定量PCR方法可用于驴肉产品中其他...     

TaqMan实时荧光PCR法定量检测生肉中猪源性成分的建立

目的:建立基于Taq Man实时荧光PCR技术的猪源性成分的定量检测方法。方法:选择朊蛋白基因为猪特异性基因和线粒体12S r RNA为内参基因,使用△Ct法进行相对定量。通过对其他种类的肉源DNA进行扩增,以验证方法的特异性;对含有1%猪肉的混合肉DNA进行系列稀释,确定检出限,并对自制模拟掺假肉进行猪源性掺假的测定,对该方法进行验证。结果:所用的引物具有较好的特异性,当模板浓度为50 ng/μL时对猪源性扩增的平均Ct值为22.73,而其他种类的肉源进行扩增时均未能检测到扩增信号,检出限为0.25%(w/w);检测结果在猪肉含量为1%~100%(w/w)范围内具有良好的线性关系,相关系数R2=0.9955。内部验证结果表明,根据标准曲线得到的盲样检测结果同样品真实含量具有较高的一致性,变异系数在0.1270%~1.2044%之间。结论:所建立的Taq Man实时定量PCR法可用于生肉中猪源性成分的定量检测。     

环介导等温扩增与qPCR用于检测肉制品中狗源性成分的比较

目的 建立基于实时荧光PCR和环介导等温扩增检测肉制品中狗源性成分的检测方法并比较2种方法的检测效能。方法 针对狗线粒体CYTB基因保守序列, 采用Primer Explorer Version 4软件设计环介导等温扩增引物, Primer Express 3.0.1软件设计实时荧光PCR引物及探针。提取狗肉基因组DNA作为阳性模板, 黄牛肉等20种基因组DNA作为阴性对照, 分析扩增特异性; 用含靶序列的人工质粒确定检测灵敏度及人工掺肉样确定最低检出限; 用市售肉制品分析检出率。结果 对于肉制品中狗源性成分检测, 实时荧光PCR和环介导等温扩增检测均有较好的特异性, 人工质粒分析灵敏度分别为0.1、1 fg/μL。对10种市售狗肉制品的狗源性成分均检出阳性、10份不含狗肉制品均检出阴性, qPCR法和环介导等温扩增法的检测结果符合率均为100%。结论 qPCR法和环介导等温扩增法在检测肉及肉制品中的狗源性成分时, 在灵敏度、检出限和准确度上具有相当的效能。     

实时荧光PCR技术快速检测奶制品中掺入的大米源性成分

目的:建立基于实时荧光PCR技术的奶制品中掺入大米源性成分的快速检测方法。方法:以水稻的根部表达基因(gos9)为靶基因设计特异性引物和探针,经特异性实验和灵敏度实验验证引物探针可行性,并经模拟含大米奶粉及市售奶类制品检测验证其实际检测能力。结果:该引物探针体系只针对大米DNA进行扩增,与奶类主成分牛、羊及其它谷类和植物性食物DNA均无交叉扩增;最低能检测到0.1ng的大米DNA,对含大米粉的模拟混合奶粉样品,检出限可达0.1%(W/W)。将其应用于21份市售奶制品样品检测,对含大米源性成分的奶制品扩增阳性,检测结果与食品标签相符。结论:该实时荧光PCR检测体系具有快速、特异、灵敏的优点,可以准确鉴定出奶制品中大米成分,适用于奶类中掺加大米源性成分的检测。