酸性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件研究

从土壤中筛选到一株产酸性植酸酶酶活较高的菌株,初步鉴定为黑曲霉,菌株最优发酵条件为:麸皮3g/100mL、(NH4)2SO4 0.5g/100mL、发酵液初始pH5.5、发酵时间84h,酶活力可达12.06U/mL。对其粗酶液的酶学性质研究表明:该酶最适作用pH值为5左右,最适温度是45℃;该酶在55℃保温30min后酶活力保留在60%左右;在酸性和中性条件下有一定的稳定性;金属离子Ca2+、Fe2+、Na+、K+、Zn2+、Cu2+对酶有一定的抑制作用,Mg2+、Ba2+对酶有一定的激活作用。     

曲霉来源果胶裂解酶PnlF的克隆表达及酶学性质分析

果胶裂解酶是一类通过β-消除机制降解果胶的多糖裂解酶，对果胶的利用具有重要意义。该研究利用真核表达载体，克隆表达了来自曲霉属Aspergillus costaricensis的酸性果胶裂解酶PnlF,经过亲和层析和凝胶过滤层析对该酶的发酵液进行了分离纯化，并对其酶学性质和降解果胶的产物进行了系统性研究。该研究成功实现了PnlF在毕赤酵母中的分泌表达，粗酶活力达到526 U/mg。PnlF的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0;其酶活力在20～30℃及pH 5～6内稳定。Ca²⁺和Mg²⁺可以大幅度提高PnlF的活力；而Ag⁺和Cu²⁺则会严重抑制其活力；此外SDS、TritonX-100、苯甲磺酰氟等化学试剂对该酶活性的抑制作用较强。     

高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建

为获得一株高产高纯度的果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌,提高果胶甲酯酶的产量,从果胶酶生产菌种中克隆了果胶甲酯酶基因pmeA,通过同源重组的原理,冻融法转化农杆菌、农杆菌介导法转化黑曲霉方法,成功构建了分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）。基本发酵培养基中发酵第9 d上清中最高酶活达到467.77 U/mL。进一步敲除重组菌株TH-2（glaA::pmeA）中背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶的编码基因asaA,获得纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA?pyrG?asaA）。该菌株在添加1%的硫酸铵的发酵培养基中培养7 d后,发酵液上清中主要的背景蛋白均消失。但是与纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）相比,果胶甲酯酶表达量有所下降,最高酶活为255.40 U/mL。重组果胶甲酯酶的最适作用温度为50 ℃,适合的温度范围是40~80 ℃,在80 ℃下仍能维持其酶活性的70%以上,适合的pH范围是3.0~5.0,最适pH为4.0。最终获得了一株温度和pH作用范围较宽的高产高纯度果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌。     

芫荽酸性磷酸酶的提取、纯化及酶学性质研究

采用硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析法,从新鲜芫荽中分离纯化出电泳纯的酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）。该酶的酶活回收率为14.20%、纯化倍数为238.60、酶比活力为295.87 U/mg、亚基分子质量约为53.8 kD;芫荽ACP酶学性质研究结果表明：该酶的最适反应温度为55 ℃,在50 ℃以下时较稳定,因此该酶对温度较敏感;该酶的最适反应pH值为5.8,在pH?4.0～7.0之间较稳定,表明该酶耐受于酸性环境;芫荽ACP的对硝基苯酚磷酸二钠Km值为0.63 mmol/L,表明该酶与底物对硝基苯酚磷酸二钠具有较高的亲和力;甲醇、乙醇、异丙醇、抗坏血酸、草酸、Cu2＋、Pb2＋、Ag＋对该酶具有强烈的抑制作用;Mg2＋、Mn2＋、Ba2＋、K＋对该酶具有一定的激活作用。     

特基拉芽孢杆菌精氨酸酶基因的重组表达及酶学性质

精氨酸酶是一种能够催化精氨酸生成尿素和L-鸟氨酸的碱性水解酶。利用分子克隆的方法得到特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）PanD37的精氨酸酶基因,在大肠杆菌中异源表达该基因后分析重组酶的性质。结果表明：该精氨酸酶编码297?个氨基酸序列;酶的最适反应温度为45?℃,最适反应pH值为10.0,在pH?8.0～10.0及50～60?℃范围内酶活力稳定,Mn2＋、Ni2＋、Co2＋对酶活力有明显的激活作用,粗酶的活力可达1?109.8?U/mL。     

南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用

为提高南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）表达量,根据黑曲霉（Aspergillus niger）密码子偏好性设计合成CALB基因,以PnaII/tpi为启动子构建CALB表达载体并转化到黑曲霉HL-1中表达,摇瓶发酵120 h后上清液中重组CALB活力为171 U/mL。研究重组CALB的酶学性质,最适反应温度和pH值分别为50 ℃和8.0,在pH 6.0～9.0和45 ℃以下具有较高的稳定性,10 mmol/L Cu2＋、Zn2＋和0.1 g/100 mL十二烷基硫酸钠强烈抑制酶活力,而1 mmol/L Ca2＋、0.1 g/100 mL山梨醇对酶活力具有非常明显的激活作用。此外,以硅藻土为载体固定CALB,固定化酶活力为187 U/g。将制备的硅藻土-CALB固定化酶用于生物合成己酸乙酯,经反应条件优化后在无溶剂体系中己酸乙酯产率达91%。     

溶菌酶LyAa在黑曲霉中的高效表达与酶学性质分析

该研究探讨了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后,构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达,利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具,使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2 291.37 U/mL,是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力（869.74 U/mL）的2.63倍,是仅使用传统单拷贝表达载体的LyAa-T菌株酶活力（358.41 U/mL）的6.39倍。通过6×His标签使用镍柱亲和层析成功纯化了重组溶菌酶LyAa,并对其酶学性质进行了分析。溶菌酶LyAa蛋白大小约为25.0 ku,最适pH值为4.0,最适温度为30 ℃,并显示出良好的胃蛋白酶稳定性。综上,该研究基于双拷贝载体和CRISPR技术成功优化和提高了溶菌酶在黑曲霉中的表达。     

黑曲霉果胶裂解酶和聚半乳糖醛酸酶合成的发酵调控

通过对黑曲霉(Aspergillus niger)wz 003液态发酵过程的调控,制备了高活性的果胶裂解酶,并讨论了发酵过程中聚半乳糖醛酸酶活力的变化情况。实验表明,发酵产酶培养基组成为(g/L):麸皮60,玉米粉40,酵母膏20,胡萝卜12,CaCO_3 10。培养条件为:初始pH 6.5,30℃,接种量8%,培养2 d。此时果胶裂解酶活力为375.3 U/mL,为基础条件下的6.225倍,而聚半乳糖醛酸酶的合成得到了有效控制,酶活仅为29.4 U/mL。改变发酵条件,有利于聚半乳糖醛酸酶的发酵生产,此时酶活力为基础条件下的5.05倍。     

黑曲霉果胶酯酶在毕赤酵母中异源表达、性质分析及脱酯工艺优化

果胶酯酶作为一种食品酶制剂,因其能够将高酯果胶的甲酯基脱去生成低酯果胶而受到广泛关注,但目前国内尚无自主研发的商品果胶酯酶。为了促进果胶酯酶的应用,该研究合成了密码子优化后的黑曲霉果胶酯酶基因,并实现了其在毕赤酵母X33中成功表达。3 L发酵罐高密度发酵96 h后,得到的发酵液上清液中果胶酯酶的活力为85.12 U/mL,是摇瓶水平的7倍,也是目前果胶酯酶表达的最高水平。对重组果胶酯酶进行分离纯化和酶学性质研究,结果表明,重组果胶酯酶的最适pH和最适温度分别是pH 5.0和55℃,K_m和V_max分别是13.8 mmol/L和9.04μmol/(L·min)。该酶的温度稳定性较好,在55℃处理40 min,剩余活力仍保持在60%以上;其pH耐受范围广,在pH 3.5～6.5下处理120 min,仍保持60%以上的剩余活力。以高酯果胶为底物,对该果胶酯酶的脱酯条件进行优化,优化得到的脱酯工艺参数为：30 g/L果胶、加酶量65.4 U/g、脱酯温度50℃、初始pH 5.5、脱酯时间60 min。在此条件下果胶的酯化度从70.8%降至13.6%。该...     

地衣芽孢秆菌碱性果胶酶基pe1B 的克隆与鉴定

果胶裂解酶(E.C.4.2.2.2)可水解聚半乳糖醛酸α-1,4糖苷键释放出可溶性的不饱和寡聚乳糖醛酸,用于水果加工、棉纺织预处理、饲料工业、咖啡和茶发酵、油提取等方面.本研究从地衣芽孢杆菌CICIM B1699染色体DNA中扩增出一种新的果胶裂解酶编码基因pelB,再将其克隆入启动子PQ下游,分别获得重组质粒pla-PQ-pelB和pHY-PQ-pelB.在重组质粒pLa-PQ-pelB的介导下,基因pelB在大肠杆菌JM109中得到表达,所表达的重组果胶裂解酶的酶学性质显示其最适反应温度为45℃,最适pH为10.5.在重组质粒pHY-PQ-pelB的介导下,基因pelB在地衣芽孢杆菌CICIM B1699中表达4.2U/mL的重组果胶裂解酶酶活,较对照菌株高出60%.     

醋酸菌中乙醛脱氢酶的分离纯化及酶学性质

以实验室筛选得到的醋酸菌(Acetobacter pomorum)为实验菌株发酵产酶,通过细胞破壁,采用(NH₄)₂SO₄沉淀、透析、DEAE-Sepharose 离子交换层析及 Superdex G-75凝胶过滤层析分离纯化得到乙醛脱氢酶的酶液,并考察其酶学性质。该酶分子质量为221.60 kDa,单个亚基分子质量约为54.41 kDa,为四聚体结构;纯酶液比活力20.25 U/mg,纯化倍数为10.16倍,乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的回收率为6.53%。酶学性质研究表明,ALDH促进乙醛分解的最适温度为50 ℃,40~50 ℃相对酶活力稳定性好;该酶的最适pH为7.0,当pH在5.5~7.5内酶活力表现稳定;金属离子对酶活性的影响实验表明,Na+、K+、Zn2+、Ba2+对该酶酶有不同程度抑制作用,而Mg2+、Ca2+、Al3+、Li+、Cu2+具有促进作用;ALDH的最适底物为乙醛,相对偏好直链醛类。ALDH活性较大,为后期表达和深入研究其生物学功能提供理论和数据支持。     

蕹菜过氧化物酶的分离纯化及理化性质

新鲜蕹菜经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶（peroxidase,POD）,该酶的比活力、回收率、纯化倍数和产率分别为35 972.96 U/mg、12.21%、168.48和211.07 U/g。该酶的亚基分子质量为42.7 kD,最适温度为40 ℃,最适pH值为6,并且在20～50 ℃及pH 5～8的范围内具有良好的稳定性。以不同浓度的H2O2为底物,测得该酶的Km值为18.32 mmol/L。NaCl、尿素（Urea）、Zn2+、Mg2+对该酶都具有较强的激活作用,十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、硫氰化钾（potassium thiocyanate,KSCN）、抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）、Ba2+、Mn2+ 、Fe2+、甲醇、乙醇、正丁醇和异丙醇对蕹菜POD活力均有抑制作用,其中抗坏血酸对POD有极强的抑制作用,当浓度为0.01 mol/L时,酶活力接近于0。     

嗜热甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌的表达及该酶在果汁澄清中的应用

探究嗜热真菌Neosartorya sp. HBFH9中甘露聚糖酶NsMan5B的酶学性质及其在果汁加工中的应用潜力。本研究从菌株HBFH9中获得nsMan5B基因,该基因全长1 491 bp（2 个内含子）,cDNA全长1 371 bp,编码456 个氨基酸和1 个终止密码子。NsMan5B酶分子由1 个信号肽序列、碳水化合物结合序列、linker序列和催化区组成。重组NsMan5B的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH 4.0,在pH 2.0～10.0和50 ℃条件下稳定。NsMan5B成熟蛋白分子质量约为49 kDa,不存在糖基化修饰。金属离子和化学试剂对该酶活性的影响差异较大,其中K＋、Mg2＋和Cu2＋等离子对酶活性促进较明显,分别使酶活力提高了271%、123%和100%。随着醇类分子碳链的延长和浓度的增加,醇类物质对重组酶NsMan5B活性的抑制作用增强,其中在正丁醇体积分数为2.5%条件下,使该酶活性降低了86%。重组NsMan5B酶对柿子汁、苹果汁、桃子汁、葡萄汁和橘子汁澄清实验结果显示,除橘子汁外,重组酶对其他果汁的澄清度都有不同程度的提高,其中柿子汁澄清度提高了31.8%,其他3 种果汁的澄清度分别提高7%、4%和4%。综上所述,甘露聚糖酶NsMan5B在果汁加工中具有较好的应用前景。     

黄瓜过氧化物酶的分离纯化及酶学性质

新鲜的黄瓜经匀浆、抽提、硫酸铵沉淀、CM-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶。该酶的比活力、回收率及纯化倍数分别为64 177.67 U/mg、9.58%、61.93。该酶的分子质量为41.15 kD,亚基分子质量为40.21 kD。该酶的最适温度和最适pH值分别为60 ℃和6。在25～45 ℃及pH 5～9的范围内非常的稳定。在测定条件下测得该酶的Km值为53.79 mmol/L。硫氰化钾对该酶活力基本无影响。尿素、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+对该酶都具有激活作用且浓度至50 mmol/L时酶活力分别被激活至112%、127%、113%、128%、139%、199%、348%,然而十二烷基磺酸钠、抗坏血酸和草酸对该酶有强烈的抑制作用;Zn2+、甲醇、乙醇和异丙醇对该酶有一定的抑制作用。     

鸭卵清溶菌酶的分离纯化及性质

通过硫酸铵的分级沉淀、CM-Sepharose阳离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等步骤,从鸭卵清中获得电泳纯的溶菌酶,该酶的比活力达到33687.26U/mg,纯化倍数为109.44,回收率为28.00%。测得该酶分子质量约为14.82kD,对溶壁微球菌的最适反应温度为50℃,最适pH值为7,且在50℃以下及pH5～9有较好的稳定性,同时在最适条件下测得其Km值为0.0864mg/mL。Fe2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对该酶有较强的抑制作用,而Zn2+、Cu2+、Co2+对该酶有一定的激活作用。     

嗜酸乳杆菌胆盐水解酶的分离纯化及酶学性质

对嗜酸乳杆菌La-XH1产生的胆盐水解酶进行分离纯化,并对其部分酶学性质进行研究。结果表明：嗜酸乳杆菌La-XH1胆盐水解酶的粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B柱层析后的酶比活力分别为47.82 U/mg和115.85 U/mg,纯化倍数分别为4.46 倍和10.82 倍,酶的回收率分别为59.89%和25.11%;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）电泳分析,该酶的分子质量约为43 kD,最适温度为40 ℃,最适pH值为6.0,Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对该酶有激活作用,其中Fe3+的激活作用最强,Na+、K+对该酶几乎无作用,而Cu2+、Ba2+对该酶有很强的抑制作用。     

木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

研究了木薯块根中β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质。以缓冲液从木薯块根中获得粗提酶液,粗酶酶活力为9.37 U/g木薯干重;再分别通过丙酮沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化,β-葡萄糖苷酶酶活力为1.14 U/g木薯干重,经纯化β-葡萄糖苷酶纯度提高了14.62倍,总活力回收率为12.14%,电泳测得其分子量约70 kDa。该酶米氏常数K_m为3.60 mmol/L,V_max为12.36μmol/(min·mg protein);其最适pH为7.0,pH在6.0～8.0之间有较好的稳定性;在40℃以内有良好稳定性,在4℃存放30 d酶活力剩余81.78%。Mn²⁺和K⁺对酶有一定的促进作用,Al³⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Na⁺、尿素和SDS对酶没有显著影响(P>0.05),而Fe³⁺、F...     

韦伯灵芝漆酶的分离纯化及其性质

采用硫酸铵分级盐析、透析、聚乙二醇浓缩和高效液相色谱柱层析从韦伯灵芝TZC-1 发酵液中分离纯化得到电泳纯漆酶,其纯化倍数为37.1 倍,酶活性回收率为21.3%。活性-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果表明该漆酶由一种同工酶组成,纯化漆酶经SDS-PAGE 检测显示为单一条带,其分子质量约为40kD。该漆酶催化底物ABTS 的最适反应温度为50～60℃,最适反应pH 值为4.6,在60℃以下和pH3.0～5.0 范围内保持稳定,以ABTS为底物的表观Km 值为13.8μmol/L。Fe2+ 完全抑制酶活,Al3+ 和Mn2+ 对该漆酶也有明显抑制作用,Hg+、Cu2+ 和Mg2+ 对该酶有明显激活作用,而Zn2+、Ba2+ 及K+ 对该酶活性影响不大。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

对裂褶茵所产内切β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化并用电泳法对其纯度进行鉴定,进而研究其酶学特性.结果表明:经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化得到电泳纯分子量约为45 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶,其最适pH为5.0,最适温度为45℃;Fe<'2+>、B...     

杂优-2平菇漆酶的分离纯化及酶学性质

将杂优-2平菇菌丝进行液体培养,发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE（diethylaminoethyl）-Sepharose fastflow层析和Superdex-200 prep grade层析等方法纯化,获得了电泳纯的杂优-2平菇漆酶,并对纯化的漆酶进行了部分酶学性质研究。结果显示,杂优-2平菇漆酶比活力为115 U/mg,分子质量约为244.0 kD,亚基分子质量约为85.6 kD。最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55 ℃,在pH 6.0～8.0及40～55 ℃范围内稳定性较好;最适条件下,以2,2’-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）为底物的Km值为2.1 mmol/L,最大反应速率（vmax）为0.117 μmol/（min·L）。Fe2＋、抗坏血酸对该酶活性具有完全抑制作用,乙二胺四乙酸、Ag＋、Mg2＋、Li＋对该酶活性影响较小;草酸、甲醇、正丁醇、K＋、Ca2＋、Ba2＋、Zn2＋、Cd2＋、Pb2＋、Mn2＋、Co2＋对该酶活性有不同程度的抑制作用;Cu2＋激活作用不明显;尿素、乙醇、异丙醇对该酶活性具有激活作用。