土霉素完全抗原的制备与鉴定

为了建立土霉素完全抗原的制备方法,实验以土霉素为半抗原,牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白,利用N,N,-二环己基碳化二亚胺(DCC)、邻联甲苯胺(o-tolidine)为偶联剂,将牛血清白蛋白与土霉素偶联制备土霉素人工完全抗原。通过偶联率的计算确定邻联甲苯胺为最佳偶联剂。随后利用红外光谱分析和免疫原性测定实验鉴定了土霉素、牛血清白蛋白和邻联甲苯胺的偶联情况。结果表明,制得的土霉素完全抗原在免疫健康的Balb/c小鼠体内能刺激小鼠机体产生最高效价为25600(ELISA)的抗血清。     

土霉素人工抗原的合成

以碳化二亚胺和戊二醛作为偶联剂，分别将土霉素(oxytetracycline，OTC)与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)进行偶联，得到复合物OTC—BSA。对复合物紫外扫描显示其扫描谱图与BSA和上霉素的图谱有明显的差异，表明BSA与土霉素偶联。分析OTC—BSA中OTC与BSA的摩尔比，以碳化二亚胺为偶联剂时，OTC：BSA摩尔比为7．97：1，而以戊二醛作为偶联剂时仅为2．58：1，说明不同的偶联剂得到的的复合物之间存在较大的差异。以摩尔比为7．97：1的OTC—BSA免疫BALB／c小鼠65d后，间接ELISA检测测定效价达1：20000。     

醋酸甲羟孕酮完全抗原制备及ELISA检测

本实验采用碳二亚胺法合成完全抗原MPA-BSA,并采用紫外分光光度法及SDS-PAGE凝胶电泳鉴定对偶合物进行鉴定,使用合成抗原对兔子进行免疫,得到抗血清,在此基础上建立醋酸甲羟孕酮酶联免疫检测方法,检测限为1.8μg/ml,线性范围为2.5～50μg/ml(r2=0.9936)。     

强力霉素人工抗原的制备及鼠源多抗的ELISA鉴定

为制备强力霉素（Doxycycline,DC）人工抗原并获得免疫学特性良好的DC鼠源多抗血清。本试验采用琥珀酸酣法在DC分子上引入羧基基团,然后采用改进碳二亚胺法（EDC）将其与载体蛋白偶联制备人工抗原,经紫外扫描（UV）和凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定其偶联效果,以30 μg/只的剂量（人工抗原）免疫4只BALB/c小鼠,并对所获鼠源多抗血清采用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定其免疫学特性。结果表明,人工抗原偶联效果良好,免疫的4只小鼠多抗血清效价均达到1:12800,且均有抑制效果,其中4号小鼠产生的多抗血清效果最佳,半数抑制浓度（IC50）为24.75 ng/mL,与土霉素、金霉素、四环素的交叉反应率分别为3.4%、3.8%、3.0%,与其他兽药及载体蛋白的交叉反应率均小于0.3%,特异性良好。本试验成功合成DC人工抗原并获得免疫学特性良好的DC鼠源多抗血清,为后期单克隆抗体的制备及免疫学快速检测方法的建立奠定良好基础。     

环丙氨嗪完全抗原的合成及免疫原性鉴定

目的合成并鉴定环丙氨嗪(cyromazine,CA)人工抗原。方法采用碳二亚胺法(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)将环丙氨嗪与牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)和鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)分别偶联;采用紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometry,UV)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和动物免疫对人工抗原进行鉴定。经过4次免疫,间接ELISA测定小鼠血清抗体效价,间接竞争ELISA测定血清灵敏性。结果 UV法和SDS-PAGE法结果初步显示半抗原环丙氨嗪和载体蛋白偶联成功;小鼠血清效价均在1:6400以上,2号小鼠多抗血清半数抑制浓度IC_(50)为27.5 ng/mL。结论本研究成功合成了环丙氨嗪的人工抗原,为环丙氨嗪单克隆抗体制备奠定基础。     

盐酸可乐定人工抗原的合成及鼠源多抗血清ELISA鉴定

目的：获得敏感性高,特异性强的新型瘦肉精盐酸可乐定（Clonidine hydrochloride,CLO）鼠源多抗血清。方法：以CLO的衍生物盐酸阿可乐定（Apraclonidine hydrochloride,ACLO）为半抗原,采用戊二醛法将ACLO分别与牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）和鸡卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）偶联,合成免疫抗原CLO-BSA和包被抗原CLO-OVA。采用紫外扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其偶联效果后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清。利用间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定其免疫学特性。结果：合成的人工抗原免疫效果较好,所获小鼠多抗血清效价均达到1∶12 800以上,其中3号小鼠敏感性最好,半数抑制质量浓度（IC₅₀）为82.75 ng/mL,与其他几种常见的瘦肉精类药物的交叉反应率均小于0.9%,特异性良好。结论：通过戊二醛法成功合成了高免疫原性的CLO人工抗原,并获得敏感性高,特异性强的CLO鼠源多抗血清。     

花粉中土霉素残留的ELISA检测

研究了花粉中土霉素的提取方法，得出最佳提取方案。以自制抗土霉素抗体建立的间接竞争ELISA法对花粉中土霉素的残留量进行了检测，所建立的间接竞争酶联免疫吸附分析法（ELISA）对土霉素的检测范围为50ng／mL～200ng／mL，在此范围内对人工污染样品的平均回收率为92．61％～104．36％。     

抗环丙沙星抗血清制备及其ELISA检测

采用碳二亚胺法和混和酸酐法,将环丙沙星与BSA 和OVA 分别合成免疫抗原(ciprofloxacin-BSA)和包被抗原(ciprofloxacin-OVA)。利用合成的免疫抗原免疫家兔,获得了抗环丙沙星的特异性抗血清。在此基础上建立环丙沙星酶联免疫检测方法(ELISA),其线性范围为0.05～10μg/ml (r=0.998)。在样品检测中与HPLC 方法具有良好的相关性。     

2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及鼠源多克隆抗血清的制备

采用碳化二亚胺法(EDC法)将2,4-D与牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联,合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,采用紫外扫描(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法进行鉴定;用2,4-D人工免疫抗原(2,4-D-BSA)免疫BALB/c纯系小鼠,采用间接ELISA测定多抗血清效价、阻断ELISA鉴定其抑制。结果表明:BSA与2,4-D偶联后,波峰出现右移,表明偶联成功;SDS-PAGE电泳中BSA的泳动速度大于2,4-D-BSA,表明2,4-D已与BSA成功偶联;6只小鼠血清效价均达到了1:1.28×104,且1号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制IC50为72.48ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力较高的鼠源抗2,4-D多克隆抗体血清,为2,4-D残留免疫学检测方法的建立奠定了良好的基础。     

泰拉霉素完全抗原的合成和鉴定

利用丁二酸酐法对泰拉霉素的羟基衍生化,引入游离羧基,合成泰拉霉素半抗原。采用活泼酯法将泰拉霉素半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,合成人工完全抗原泰拉霉素-BSA和泰拉霉素-OVA。利用LC-MS鉴定衍生化后半抗原的合成,利用荧光光谱、考马斯亮法鉴定完全抗原的合成。用泰拉霉素-BSA免疫小鼠,采用间接ELISA法测定小鼠抗血清效价。泰拉霉素半抗原和BSA的偶联比为17∶1。三免后小鼠抗血清效价可达1∶8 000。     

草甘膦人工抗原的制备及兔源多抗的ELISA鉴定

采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDC)法和戊二醛(glutaraldehyde,GA)法,合成了草甘膦(N-(phosphonomethyl)glycine,PMG)人工抗原,通过免疫制备高敏感性、特异性的兔PMG多克隆抗血清并进行鉴定。将PMG分别与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)偶联,合成免疫抗原PMG-BSA和包被抗原PMG-OVA。经紫外扫描、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后,免疫新西兰大白兔,制备多抗。利用间接酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定多抗效价,间接竞争ELISA方法测定血清的敏感性和特异性。结果表明,免疫的3只兔血清效价均达1∶104以上,2号兔多抗效果最好,半数抑制浓度(IC50)为30.9μg/m L,且具备良好的特异性。本实验成功合成了PMG人工抗原,并制得了敏感性高、特异性好的兔多抗,为PMG的免疫学快速检测方法的提供参考。     

葡萄酒中桔青霉素快速检测间接竞争ELISA方法的建立

该研究利用桔青霉素（CIT）结构中的羧基、活泼氢和羟基分别与牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）和血蓝蛋白（KLH）进行偶联制备全抗原。经小鼠免疫,采用间接竞争酶联免疫吸附（IC-ELISA）法筛选出具有最佳竞争性反应的配对抗血清和包被抗原,并构建快速检测葡萄酒中CIT的IC-ELISA法。结果表明,最优抗血清为免疫CIT-KLH（H）的血清,包被抗原为CIT-BSA（H）,基于此构建的IC-ELISA法的检测线性范围为0.1～100 μg/L（R2=0.969 88）,检测限为0.1 μg/L,桔青霉素抗血清半数抑制浓度（IC50）值为9.8 μg/L,抗血清对沙丁胺醇、莱克多巴胺、展青霉素和黄曲霉毒素B1无交叉反应性。该方法在葡萄酒中检测CIT的加标回收率为92.01%～119.33%,加标回收率试验结果的相对标准偏差（RSD）为2.35%～5.22%,体积分数14%的乙醇对IC-ELISA检测结果无显著性影响（P＞0.05）,表明可直接上样快速检测葡萄酒中残留的桔青霉素。     

玉米赤霉烯酮全抗原的合成及鉴定

目的合成玉米赤霉烯酮(ZEN)的全抗原。方法将烯醇化的ZEN与阳离子化的载体蛋白(BSA)偶联,制备高特异性的全抗原,用高性能基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOF检测偶联物及载体蛋白的分子量,用商品化的ZEN免疫试剂盒对偶联物进行棋盘滴定验证。结果全抗原及载体蛋白BSA的分子量分别为69693.5 Da、66297.7 Da,平均每个BSA连上的ZEN分子个数为10.68个;平均每个OVA上连上的ZEN分子个数为5.32个;偶联物与免疫试剂盒中ZEN的抗体呈阳性反应。结论合成的ZEN全抗原为ZEN抗体的制备及免疫学方法的建立奠定了基础。     

莱克多巴胺人工抗原及抗体的制备

莱克多巴胺是一种禁用β-兴奋剂,建立莱克多巴胺药残的快速检测方法是实现对其进行有力监控的有效途径,而莱克多巴胺抗体是快速免疫检测法的基本试剂。本实验用全新的方法研究了莱克多巴胺免疫原的合成,采用对氨基苯甲酸(ABA)和1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDE)将莱克多巴胺分别和cBSA、cOVA偶联,合成了莱克多巴胺的免疫原和包被抗原,并对其进行了紫外分析。用免疫原免疫新西兰大白兔,获得了高灵敏度和特异性的莱克多巴胺多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的IC50值为4.34ng/ml,所得多克隆抗体效价达到102400。     

重金属铜的单抗的制备及免疫学检测方法的建立

目的:制备针对重金属铜离子的单克隆抗体,建立Cu2+的间接和直接竞争ELISA检测法,实现对Cu2+的快速定量测定。方法:利用双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA将Cu2+分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,制备免疫原和检测原;用免疫原免疫Balb/c小鼠;细胞融合后,通过间接及间接竞争ELISA筛选稳定分泌抗重金属铜的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;制备腹水型单抗并进行鉴定;建立间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。结果:成功筛选出4株稳定分泌抗重金属铜的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中G8制备出腹水型单抗效价为5×105倍,抗体亚型为Ig G1型,轻链类型为κ型,特异性检测结果表明该单抗对NOTA及Mn2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+等其金属离子交叉反应率远低于2%,与Mg2+交叉反应率小于8%,表明单克隆抗体G8对重金属Cu2+具有很强的特异性,不会干扰结果的准确性;建立间接竞争ELISA的检测灵敏度为29.8 ng/m L,检测限为2.4 ng/m L,线性范围为4.5¹96.7 ng/m L;直接竞争ELISA检测法的检测灵敏度为12.89 ng/m L,检测限为0.88 ng/m L,检测范围为1.72⁹6.58 ng/m L。结论:成功制备出抗重金属铜离子的单克隆抗体,并建立了间接竞争ELISA和直接竞争ELISA。      

对甲基苯甲酸连接的氯霉素全抗原合成与鉴定

以对氯甲基苯甲酸(CBA)或对氯甲基苯甲酸甲酯(MCB)分别与氯霉素(CAP)反应合成氯霉素-对甲基苯甲酸半抗原(CAP-MBAⅠ、CAP-MBAⅡ),再与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备全抗原;通过紫外、荧光光谱扫描定性鉴定合成成功;bradford法结合TNBS法定量计算出全抗原表面半抗原密度(HD)。再将CAP-MBAⅡ与卵清蛋白(OVA)合成包被抗原(CAP-MBAⅡ-OVA),间接竞争ELISA计算其抑制率。研究结果表明,半抗原全抗原偶联效率优于CAP-MBAⅠ,MCB与CAP反应合成的半抗原CAP-MBAⅡ更适合蛋白偶联。采用CAP-MBAⅡ-OVA作为包被抗原可以提高ELISA检测的抑制率从而增加其灵敏度。