定点突变提高极端嗜热α-淀粉酶ApkA的高温活性和热稳定性

极端嗜热α-淀粉酶具有优良的高温活性和热稳定性,因此在淀粉液化工艺中具有巨大的应用潜力,并且其高温适应性机制研究可以为构建耐高温α-淀粉酶提供理论依据和设计思路。通过分析来源于极端嗜热古生菌Thermococcus kodakarensis KOD1的α-淀粉酶Apk A的氨基酸序列,构建缺失信号肽突变体ApkAds和单点突变体ApkAdsA180K。酶学性质分析表明,与ApkAds相比,突变体ApkAdsA180K的高温活性和热稳定性明显提高。其中ApkAds的最适反应温度为90℃,对应的酶比活力为2 946.75 U/mg;突变体ApkAdsA180K的最适反应温度为100℃,对应的酶比活力为4 501.08 U/mg。ApkAds于90℃的半衰期约为5 h,突变体ApkAdsA180K于90℃的半衰期约为7 h。通过同源模建得到的蛋白质三级结构显示,突变体ApkAdsA180K中氨基酸残基K180与D212间形成离子键。本研究结果表明ApkAdsA180K中K180与D212间离子键有利于其维持其高温活性和热稳定性。     

L-阿拉伯糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性的体外试验研究

目的探讨L-阿拉伯糖对小肠α-葡萄糖苷酶的抑制作用及与阿卡波糖的联用效应。方法利用体外实验,提取大鼠小肠粘膜上清液为α-葡萄糖苷酶粗酶液,分别以终浓度为60 mg/ml蔗糖、20 mg/ml麦芽糖/α-糊精为底物,建立最佳抑制反应体系,测定L-阿拉伯糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC50)及抑制作用类型;采用4×3析因设计,研究L-阿拉伯糖与阿卡波糖联用效果。结果以蔗糖、麦芽糖、α-糊精为底物时,L-阿拉伯糖对小肠α-葡萄糖苷酶活性均有一定抑制作用,但选择性较高地抑制蔗糖酶活性,当L-阿拉伯糖添加量为0.5%蔗糖浓度时酶活性抑制百分率>50%,最高酶活性抑制百分率约93%,且有良好剂量-反应关系,IC50为0.164 mg/ml,抑制类型为反竞争性抑制(Ki,0.558 mg/ml);与阿卡波糖联用二者有交互作用,尤其以蔗糖为底物时联用效果较明显,联合应用可能提高了抑制活性。结论 L-阿拉伯糖有抑制α-葡萄糖苷酶活性作用,尤其对蔗糖酶有良好的选择性抑制;在α-葡萄糖苷酶抑制作用方面,其与阿卡波糖有一定联用效果,L-阿拉伯糖在含糖食品中可能有较良好的实际应用前景。     

L-阿拉伯糖生理活性研究进展

L-阿拉伯糖是植物中特有的五碳醛糖,具有良好的理化性质和健康功能,可广泛应用于食品、化工、医药等各个领域.L-阿拉伯糖具有抑制蔗糖吸收、改善胰岛素抵抗、降低血清甘油三酯、减少脂肪生成和改善肠道环境等方面的生理活性.作者综述了近年来L-阿拉伯糖生理活性的研究进展及作用机制,为L-阿拉伯糖进一步开发利用提供依据.     

重视功能糖产业 推广健康新产品

正普通蔗糖属于六碳糖,但是食用过量的蔗糖有很大危害,因此蔗糖也被称为"白色毒品"。而作为五碳糖的L-阿拉伯糖生理作用却非常奇特,L-阿拉伯糖最具有代表性的作用就是影响人体蔗糖酶的活性,屏蔽过量的蔗糖吸收,从而达到抑制肥胖(即减肥)、降低血糖的作用。但是,近年来,具有显著社会效益、经济效益和市场发展前景的大众健康新产品L-阿拉伯糖却遭遇了"非典型"产能过剩问题。     

N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkA酶学性质的影响

为探索N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶Apk A酶学性质的影响,同时为构建酵母工程菌奠定基础,将Apk A缺失信号肽突变体Apk Ads及含有2个潜在N-糖基化修饰位点的突变体Apk Ads D182N/G373S在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。Apk Ads和Apk Ads D182N/G373S在Pichia pastoris GS115中大量表达并分泌到胞外,Apk Ads的表观分子质量约为45 k D,Apk Ads D182N/G373S的表观分子质量约为55 k D。酶学性质分析表明,与Apk Ads相比,Apk Ads D182N/G373S的酶学性质发生了一定的变化。其最适反应p H值由6.5降低至5.5~6.0,酸性条件下稳定性增强;最适反应温度由90℃提高至100℃;于90℃的半衰期由5 h增加至5.5 h,于100℃保温10 min后的相对酶活力由32.03%增加至49.04%。结果表明N-糖基化修饰可适当提高Apk A的酸性条件下酶活力和稳定性、最适反应温度、热稳定性。突变体Apk Ads D182N/G373S的酶学性质使其适于淀粉液化工艺的应用。     

玉米皮酸解提取L-阿拉伯糖的工艺研究

L-阿拉伯糖是一种没有热量的甜料,属于五碳醛糖.其最大功能是可以选择性对肠道内蔗糖酶的活性起非竞争性抑制作用,对蔗糖的代谢转化有显著阻断作用,抑制因摄入蔗糖而导致的血糖升高,从而具有降血糖和减肥的功效.摄入适量的L-阿拉伯糖还能促进双歧杆菌的增殖,调节人体肠道的菌群.美国医疗协会将L-阿拉伯糖列入抗肥胖剂的营养补充剂或非处方药.日本厚生省的特定保健用食品清单中将L-阿拉伯糖列入调节血糖的专用特殊保健食品添加剂.然而受限于其生产,目前国内外市场上的阿拉伯糖价格昂贵,因此本文采用正交方法研究了用草酸水解玉米皮生产L一阿拉伯糖的工艺条件,得出最佳工艺条件为:草酸浓度0.5%,酸解温度90℃,酸解时间2.5h,最佳条件下L-阿拉伯糖的收率为10.08%(干物质计).以期对稀有功能糖L-阿拉伯糖的开发提取提供一定的理论参考.     

L-阿拉伯糖的生理功能及市场应用进展

L-阿拉伯糖是一种天然五碳醛糖,可以发生美拉德反应和焦糖化反应,在食品加工中具有很好的特性。L-阿拉伯糖几乎不被人体利用,其被证明可以与小肠中的蔗糖酶结合降低酶活性,减少蔗糖的消化吸收,进而降低由蔗糖引起的血糖和胰岛素水平的升高,另外一些研究数据表明L-阿拉伯糖也具有肠道调节功能。目前L-阿拉伯糖已经被广泛应用到各类食品中。本文对L-阿拉伯糖的生理功能及市场应用等方面的进展进行综述。     

北京棒杆菌Corynebacterium pekinense天冬氨酸激酶P184M酶动力学分析及酶学性质表征

目的研究北京棒杆菌天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)184位点脯氨酸(proline,P)突变为蛋氨酸(DL-methionine,M)对酶动力学及酶学性质的影响。方法对北京棒杆菌AK家族同源序列比对,选择出高度保守且远离底物结合位点的Pro184位点,对其进行饱和定点突变,成功构建突变体P184M。结果动力学和酶学性质研究表明:P184M AK Vmax比WT(wide type)提高了5.06倍;n值为0.19,突变体由WT的正协同性变为负协同性,同时Km(mol/L)值增大;突变体AK最适pH为6.5,低于野生型最适pH 7.0;最适反应温度28℃,低于WT的30℃,适宜温度区间变窄;半衰期由WT的2.1 h降为1.2 h;金属离子、有机溶剂和抑制剂Thr+Met、Lys+Met、Thr+Lys+Met对突变株AK均表现出激活作用。结论突变体天冬氨酸激酶P184M的酶动力学性质和酶学性质改变显著,为构建高产蛋氨酸菌株提供了一定的参考依据。     

酵母蔗糖酶酶学性质的研究

本实验对啤酒酵母中蔗糖酶的酶学性质进行了初步的研究.结果表明:啤酒酵母蔗糖酶的最适pH为5.0,最适温度为35℃,Km和Vmax分别为0.057mol/L和4.79 mg/(mL.min).     

碳源对Bacillus cereus CZ氨肽酶产量及糖代谢酶活性的影响

本文对Bacillus cereus CZ生产亮氨酸氨肽酶(LAP)进行了研究。结果表明,L-阿拉伯糖最利于LAP生产,D-半乳糖和乳糖也有较好效果,葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或碳酸氢钠则强烈抑制LAP产生。L-阿拉伯糖和单糖混合、乳糖或半乳糖与葡萄糖混合均大大降低LAP产量。乳糖、葡萄糖有利于细胞生长。2%的乳糖、半乳糖或阿拉伯糖作为碳源,发酵48 h时LAP产量并没有达到最高。对于三种糖代谢酶,β-半乳糖苷酶受乳糖强烈诱导,D-半乳糖则强烈抑制该酶的活性,半乳糖激酶受D-半乳糖强烈诱导。L-阿拉伯糖异构酶受L-阿拉伯糖强烈诱导。当L-阿拉伯糖和半乳糖的浓度为4%时,LAP产量达到最高。胞外半乳糖激酶随D-半乳糖增加而降低,而胞内正好相反。L-阿拉伯糖异构酶活性随L-阿拉伯糖浓度增加而增加。当L-阿拉伯糖为4%时,LAP产量在发酵56 h达到最高,但在半乳糖为4%时,LAP产量随时间延长而增加。     

重组蔗糖磷酸化酶表达培养基的优化及化学试剂对酶活的影响

为了提高重组蔗糖磷酸化酶的表达水平,本研究通过单因素实验,研究了不同的碳源、氮源、稳定剂和金属离子对重组蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中表达的影响,并通过正交试验确定了最优的重组蔗糖磷酸化酶表达培养基的成分。另外,本研究也考察了不同的化学试剂和金属离子对重组蔗糖磷酸化酶的活性影响。结果表明,维生素C和FeCl₂显著（P<0.01）抑制了蛋白的表达,Cu2+和Zn2+完全抑制了菌体的生长,而淀粉、K+和Mg2+对重组蔗糖磷酸化酶的表达具有一定的促进作用,且三者的协同作用可以极大的提高重组蔗糖磷酸化酶的表达效率。其中在50 mL LB培养基中加入0.5%淀粉、0.1% K+和0.05% Mg2+的组合,总酶活达1207.83 U,比优化前提高了3.6倍。,Fe2+（10 mmol/L）、Mg2+（10 mmol/L）、牛血清蛋白（1%）和土温80（0.1%）均可在一定程度上提高该酶的活性。     

哈密瓜(Cucumis melo L.)致腐真菌的鉴定

研究从哈密瓜表面分离出引起其腐败的菌株A和菌株B,并采用显微镜形态学观察、表型特征和分子生物学三种方法对其进行鉴定。结果发现菌株A可利用碳源包括杏苷、糊精、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、麦芽糖、肝糖、L-鼠李糖、L-山梨糖、L-乳酸等72种碳源,其ITS rDNA序列与尖孢镰刀菌甜瓜转化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)的同源性为99%,分支长度为0.00。菌株B可利用碳源包括L-阿拉伯糖、D-果糖、丙三醇、蔗糖和木糖醇等54种碳源,其ITS rDNA序列与链格孢菌(Alternaria alternata)的同源性为100%,分支长度为0.00。因此,推断菌株A为尖孢镰刀菌甜瓜转化型,菌株B为链格孢菌。     

Putative xylose and arabinose reductases in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae mutants, in which open reading frames (ORFs) displaying similarity to the aldo-keto reductase GRE3 gene have been deleted, were investigated regarding their ability to utilize xylose and arabinose. Reduced xylitol formation from D-xylose in gre3 mutants of S. cerevisiae suggests that Gre3p is the major D-xylose-reducing enzyme in S. cerevisiae. Cell extracts from the gre3 deletion mutant showed no detectable xylose reductase activity. Decreased arabitol formation from L-arabinose indicates that Gre3p, Ypr1p and the protein encoded by YJR096w are the major arabinose reducers in S. cerevisiae. The ypr1 deletion mutant showed the lowest specific L-arabinose reductase activity in cell extracts, 3.5 mU/mg protein compared with 7.4 mU/mg protein for the parental strain with no deletions, and the lowest rate of arabitol formation in vivo. In another set of S. cerevisiae strains, the same ORFs were overexpressed. Increased xylose and arabinose reductase activity was observed in cell extracts for S. cerevisiae overexpressing the GRE3, YPR1 and YJR096w genes. These results, in combination with those obtained with the deletion mutants, suggest that Gre3p, Ypr1p and the protein encoded by YJR096w are capable of xylose and arabinose reduction in S. cerevisiae. Both the D-xylose reductase and the L-arabinose reductase activities exclusively used NADPH as co-factor.     

Novel transglucosylating reaction of sucrose phosphorylase to carboxylic compounds such as benzoic acid

We examined the synthesis of benzoyl glucoside using the transglucosylation reaction of sucrose phosphorylase. Sucrose phosphorylase from Streptococcus mutans showed marked transglucosylating activity, particularly under acidic conditions. On the other hand, sucrose phosphorylase from Leuconostoc mesenteroides showed very weak transglucosylating activity. Three main products were detected from the reaction mixture using benzoic acid as an acceptor molecule and sucrose as a donor molecule. These compounds were identified as 1-O-benzoyl alpha-D-glucopyranoside, 2-O-benzoyl alpha-D-glucopyranose and 2-O-benzoyl beta-D-glucopyranose on the basis of their isolation and the isolation of their acetylated products and subsequent analysis using 1D- and 2D-NMR analyses. From the results of the time-course analyses of the enzyme reaction and the degradation of 1-O-benzoyl alpha-D-glucopyranoside, 1-O-benzoyl alpha-D-glucopyranoside was considered to be initially produced by the transglucosylation reaction of the enzyme, and 2-O-benzoyl alpha-D-glucopyranose and 2-O-benzoyl beta-D-glucopyranose were produced from 1-O-benzoyl alpha-D-glucopyranoside by intramolecular acyl migration reaction. The acceptor specificity in the glucosylation reaction of S. mutans sucrose phosphorylase was also investigated. This sucrose phosphorylase could transglucosylate toward various carboxylic compounds. Short-chain fatty acids, hydroxy acids and dicarboxylic acids were also glucosylated with this sucrose phosphorylase.     

枯草杆菌蛋白酶QK的活性与氨基酸突变位点的相关性

目的:鉴定不同来源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生的枯草杆菌蛋白酶QK(subtilisin QK)的活性与编码其序列的氨基酸位点突变的相关性。方法:以筛选得到的15株菌株的总DNA为模板,细菌16S rRNA为通用引物,进行PCR扩增,将产物测序后输入NCBI比对,确定其均为枯草芽孢杆菌属。再扩增这15株菌株的QK基因,测序后与GenBank上已提交的QK基因所对应的蛋白序列进行比对,找出氨基酸差异位点。使用纤维蛋白平板法测定菌株所产枯草杆菌蛋白酶的活性,用BCA蛋白测定试剂盒测定发酵液的总蛋白含量,并计算得到单位酶活。结果:根据突变位点的不同把15株菌株分为A、B、C、D四组。A组的突变位点为S184T,单位酶活显著最高(p<0.05);B组的突变位点为Q90K,N193S,S236T,N365S,C组的突变位点为N193S,S236T,A289V,B、C两组之间单位酶活并无显著性差异(p>0.05),但B、C 两组单位酶活显著小于A组(p<0.05);D组的突变位点为Q90K,N193S,S236T,A289V,单位酶活显著低于其他三组(p<0.05)。结论:枯草杆菌蛋白酶QK的单位酶活与氨基酸突变位点之间有相关性:S184T和N365S位点变化对单位酶活性有促进作用,A289V位点变化对单位酶活性有抑制作用。据此推测,这些位点位于枯草杆菌蛋白酶QK的活性中心。     

定向进化植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌高产共轭亚油酸

为获得高产共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）的菌株，对亚油酸异构酶系植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原（myosin-cross-reactive antigen，MCRA）基因mcra和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因lai-p进行克隆，克隆成功后连接到骨架质粒pCold-SUMO上构建两种含mcra基因和lai-p基因的大肠杆菌重组菌株，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷低温诱导阳性重组菌蛋白表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证得到目的蛋白表达条带，说明两种基因表达成功。采用易错聚合酶链式反应定向进化mcra基因和lai-p基因，构建重组菌突变体库，利用流式细胞术分选获得吸光度提高和CLA产量提高的重组菌株，其中pCold-ycmcra-gfp重组菌243 株，吸光度最高的为155号菌1.050 6±0.000 4，提高了5.02 倍；pCold-yclai-p-gfp重组菌156 株，产量最高的为39号菌（11.62±0.003 6）μg/mL，提高了2.99 倍。本研究为后期深入了解突变菌株CLA产量提高的原因，并获得两种亚油酸异构酶的产酶机制奠定了一定基础。     

二硫键对Enterocin A抗李斯特菌LIN 3活性的影响

依据Enterocin A的氨基酸序列,设计半胱氨酸替换突变体Enterocin A(C14S)和Enterocin A(C47W),通过大肠杆菌表达系统获得重组突变体。用还原剂β-巯基乙醇处理MBP-Enterocin A。采用琼脂扩散实验检测重组Enterocin A、突变体及还原产物的抗无害李斯特菌LIN3活性。结果表明：N末端融合部分不含有半胱氨酸的MBP-Enterocin A或His tag-Enterocin A均表现强抗菌活性;而N末端融合部分含有半胱氨酸的GST-Enterocin A,表现很弱的抗菌活性;半胱氨酸替换突变体及MBP-Enterocin A还原产物均不显示抗菌活性。实验结果证明二硫键为Enterocin A活性的重要影响因素。     

Enzymatic synthesis of novel oligosaccharides from L-sorbose, maltose, and sucrose using kojibiose phosphorylase

Glucosyl-L-sorbose, -maltose, and -sucrose were synthesized using kojibiose phosphorylase (KPase) from Thermoanaerobacter brockii ATCC35047 with beta-D-glucose-1-phosphate (beta-G1P) as a glucosyl donor. One disaccharide and two trisaccharides thus synthesized were isolated by Toyopearl HW-40S column chromatography. The results of KPase digestion, methylation analysis, and 13C-NMR studies indicated that these oligosaccharides were alpha-D-glucopyranosyl-(1-->5)-alpha-L-sorbopyranose, alpha-D-glucopyranosyl-(1-->2)-alpha-D-glucopyranosyl-(1-->4)-D-glucopyranose (4-alpha-D-kojibiosyl-glucose), and alpha-D-glucopyranosyl-(1-->2)-alpha-D-glucopyranosyl-(1-->2)-beta-D-fructofuranoside, which are all novel oligosaccharides. Glucosyl-L-sorbose was partially hydrolyzed to glucose and L-sorbose by alpha-glucosidases, while glucosyl-sucrose and glucosyl-maltose were not hydrolyzed by glucoamylase, alpha-glucosidases, or CGTase.     

库巴德巴利酵母FBKL2.0130 D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因的克隆表达及酶学性质研究

该研究从库巴德巴利酵母FBKL2.0130中克隆D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因ARD,利用闪电克隆技术构建重组质粒Yep-PAK,并将重组质粒导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A中,得到重组菌株W303-ARD并成功表达。并对重组菌株和亲本菌株的生长性能进行测定,并对重组D-阿拉伯糖醇脱氢酶酶学性质进行研究。结果表明,与亲本菌株相比,重组菌株的D-阿拉伯糖醇脱氢酶的还原活力从（32.7±0.803） U/mL提高至（122.4±1.012） U/mL,氧化活力从（18.46±0.105） U/mL提高至（97.30±0.826）U/mL。重组D-阿拉伯糖醇脱氢酶的最适反应温度为30 ℃,在25～40 ℃范围内氧化、还原活力均保持稳定。还原反应的最适pH值为9.0,在pH 9.0～11.0范围内比较稳定;氧化反应的最适pH值为7.0,在pH 7.0～8.0的范围内能保持较高的活性。Cu2+、Ba2+、Zn2+均能抑制重组酶活力;Mg2+对重组酶活力无明显影响;Ca2+、Mn2+、Fe3+均能提高重组酶活力。