苹果转录因子MdHB1的原核表达与多克隆抗体制备

HD-Zip转录因子在植物生长发育过程中具有重要作用,蛋白水平的研究有助于进一步阐释其功能。将苹果转录因子基因MdHB1分别连接到pGEX-6p-1和pET-28a（＋）表达载体,热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,随后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导培养,分别得到了带有GST和6×His标签的MdHB1融合蛋白（分别命名为MdHB1-GST和MdHB1-His6）。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,在?18、28?℃和37?℃?3?个温度诱导条件下都是沉淀中MdHB1-GST融合蛋白的量较多,37?℃尤为明显,较低的诱导温度（18?℃和28?℃）能够提高融合蛋白MdHB1-GST可溶性形式存在的比例;28?℃条件下50?mg/L IPTG诱导的总蛋白量在8?h左右达到最大,且受IPTG质量浓度（10、50、100?mg/L）的影响不大。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白MdHB1-His6为抗原,成年兔免疫以制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明,所得抗体效价较高。蛋白质免疫印迹实验结果说明,所制备多克隆抗体特异性良好,能够从菌体和苹果幼叶总蛋白中成功检测MdHB1蛋白。综上所述,本实验所得多克隆抗体能够用于深入研究MdHB1在植物体内的功能。     

Acidothermus cellulolyticus 11B葡萄糖异构酶基因的克隆、表达及酶活性研究

葡萄糖异构酶是生物法转化葡萄糖为果糖制备果葡糖浆的关键酶。本文克隆到一种葡萄糖异构酶基因xyl,来源于嗜酸耐热型微生物Acidothermus cellulolyticus 11B(ATCC43068)。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的重组葡萄糖异构酶过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约43kDa处出现显著的特征蛋白条带;活性检测结果表明该重组葡萄糖异构酶具有较高的果糖转化活性。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及高效表达

扩增了枯草芽孢杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因（gdh）,构建了诱导型表达载体pET-gdh,导入E.coliBL21（DE3）后获得了高效表达葡萄糖脱氢酶基因的重组菌BL21/pET-gdh。经过诱导时间、诱导温度参数的优化,IPTG诱导后重组菌BL21/pET-gdh的葡萄糖脱氢酶比酶活高达9.65 U/mg蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,重组蛋白质表达量占全菌胞内可溶性蛋白的53%,实现了葡萄糖脱氢酶基因的高效表达,为氧化还原酶催化系统提供高效率的NADP＋与NADPH循环奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌噬菌体qdsa001内溶素的特性预测及克隆表达

为获得噬菌体qdsa001的内溶素,本实验首先利用多种在线软件对内溶素lys56（GenBank：ARQ95812.1）的理化性质、信号肽、跨膜域和结构域等特性进行分析,然后选择克隆表达法制备目的蛋白。将合成的目的基因插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET-30a-lys56,转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中,获得表达稳定的基因工程菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,利用镍琼脂糖亲和层析纯化表达产物。经在线软件预测结果显示,该蛋白分子质量为35.1 kDa,无信号肽和跨膜域,仅含有一个Ami_2结构域。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示重组蛋白表达成功,且以可溶性蛋白的形式存在于细胞破碎上清液,分子质量约35?kDa,与预期蛋白大小一致。重组蛋白最佳表达条件为：IPTG浓度0.5?mmol/L,20?℃过夜诱导。     

耐热果胶裂解酶基因pel9A的克隆和表达

利用PCR技术从耐热梭状芽孢杆菌（Clostridium stercorarium）中扩增得到产耐热果胶裂解酶的结构基因pel9A,并将其克隆于表达载体pET28a中,最后将此重组质粒转化到受体菌E.coli BL-21中进行表达.诱导条件为：37 ℃诱导5 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L.重组菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表达的蛋白质的相对分子质量为130 000,与预期相对分子质量相符.细胞经超声破碎后,测得果胶酶的比酶活为15 U/mg粗蛋白.     

鲫鱼MBSP的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)的原核表达菌株Rosetta(pET28aMBSP),获得重组MBSP,以制备MBSP多克隆抗体。将鲫鱼MBSP全长基因(MBSP)借助表达载体pET-28a构建重组表达菌株Rosetta(pET28a-MBSP),并进行诱导表达后获得重组MBSP。利用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化重组蛋白并进行质谱鉴定。以纯化后的重组MBSP作为抗原免疫新西兰兔,获得MBSP多克隆抗体。分别采用ELISA和Western blot技术测定其效价和特异性。诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析、Western blot检测及质谱鉴定,结果表明该蛋白质为重组MBSP,其相对分子质量约为28×10~3,与天然MBSP大小一致,主要以包涵体形式存在。将其免疫兔子后,从血清中获得了与MBSP发生特异性反应的高效价多克隆抗体。本研究中成功表达和纯化了重组MBSP蛋白,制备了高效价的特异性MBSP多克隆抗体,为MBSP的相关研究奠定基础。     

栽培大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）全长cDNA的克隆及原核表达

根据NCBI中发表的大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）序列（AF303939-1）设计特异引物,以吉农13大豆为实验材料,采用Trizol法提取叶片总RNA,通过RT-PCR克隆大豆rbcS的cDNA。将该基因与原核表达载体pET-30a（＋）连接,转化大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,双酶切鉴定后筛选阳性克隆,测序结果显示：rbcS全长696bp,其中开放阅读框为537bp,编码178个氨基酸;选择含大豆rbcS cDNA阳性克隆菌液IPTG诱导,经SDSPAGE分析,诱导表达出分子量为29.1kDa的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符。诱导7h蛋白表达量最高,为64.15%。     

在酿酒酵母中共表达sXYLA和XKS1及木糖发酵的初步研究

为改善重组酵母发酵木糖生产乙醇的能力,将定点突变改造后的Thermus thermophilus木糖异构酶基因sXYLA克隆到酵母表达载体pYX212并用于转化酸酒酵母Saccharomyces cerevisiae YPH499进行表达研究。酶活检测表明,改造后的木糖异构酶活性是未改造的1.91倍。在此基础上将改造后具有良好特性的木糖异构酶基因sXYLA和来自酸酒酵母的木酮糖激酶基因XKS1耦联,构楚得到重组表达质粒pYX-sXYLA- XKS1,在酿酒酵母YPH499中实现组成型共表达。结果表明,在84 h时重组菌发酵液酶活达到最高,木糖异构酶为0.624 U/mg蛋白,木酮糖激酶为0.688 U/mg蛋白。以葡萄糖和木糖为混合碳源初步进行半通氧发酵,代谢产物分析表明酸酒酵母重组菌木糖的消耗为4.75 g/L,乙醇的产量为0.839 g/L,分别比出发菌提高20.9%和14.8%,为酿酒酵母利用木糖发酵乙醇奠定基础。     

枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以枯草芽孢杆菌DB104染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因tg,将其克隆至大肠杆菌质粒pET-22b( )中,构建表达栽体pET-tg,并转化大肠杆菌BL21(DE3).重组菌经IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)诱导,SDS-PAGE电泳分析,结果表明谷氨酰胺转胺酶得到了表达,表达量占菌体总蛋白的12%.诱导菌体经裂解后的上清与酪蛋白反应,显示其具有交联蛋白质的活性.经荧光法测定,诱导5 h的菌体酶活为1 590 U/g(DCW,cell weight,细胞干重),是出发菌株30 U/g(DCW)的52倍.     

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

蔗糖异构酶基因在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达及重组菌的细胞固定化

分别利用IPTG和乳糖两种诱导物诱导蔗糖异构酶(SIase)基因在E.coliBL21(DE3)中实现表达,对诱导温度、诱导时机、诱导物浓度、诱导持续时间进行比较分析并优化,确定了二者的最佳诱导条件,在E.coli培养3h后(OD600约为0.9)添加终浓度为0.8mmol/L的IPTG(0.5mmol/L乳糖)在20℃(24℃)条件下诱导14h(12h)能获得最高的蛋白表达量及SIase酶活。在最优条件下以IPTG为诱导物时目的蛋白占总蛋白的41.6%,单位体积培养液中SIase酶活为12.37U/mL,以乳糖为诱导物时分别为27.2%,14.72U/mL,从收获酶活角度考虑可见乳糖作为诱导物的优势;而后利用海藻酸钠包埋法固定化重组菌,转化初始浓度为500g/L的蔗糖溶液,转化10～11h后异麦芽酮糖平均得率在83%以上,蔗糖平均转化率大于99%,固定化细胞能够连续稳定转化25批次,转化效率相对于原始菌提高了近55%。     

不同采收贮藏条件下鸭梨果实LOX基因表达及其与果心褐变的关系

以河北鸭梨为试材,通过测定鸭梨果实呼吸强度、乙烯释放量、果心褐变指数等生理指标变化及不同部位脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）基因表达特性和LOX活性变化,研究了两种降温条件下不同采收成熟度鸭梨LOX基因表达及其与鸭梨果心褐变的关系。结果表明：不同贮藏期果心LOX活性及果心褐变指数顺序均为晚采果＞早采果＞中采果,急速降温果＞缓慢降温果;贮藏期间,鸭梨果心LOX基因表达量呈现先缓慢上升后下降,贮藏末期又上升的变化趋势;急速降温鸭梨LOX基因表达量大于缓慢降温果,中采果LOX基因表达量小于早采及晚采果。中采结合缓慢降温抑制了鸭梨果肉及果心部位LOX基因表达,进而减少了果心褐变的发生;LOX基因的表达与LOX活性及鸭梨褐变指数变化趋势一致,说明该基因与鸭梨褐变关系密切。     

苹果ACO1基因及转录因子MdHB-1基因的表达模式

研究苹果MdACO1基因及转录因子MdHB-1基因在不同器官和不同发育阶段的表达量及其对外源乙烯的反应,以期探讨两基因之间的可能关系。以苹果品种“皇家嘎拉”为试材,利用实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析不同器官和果实不同发育阶段基因的表达,以及乙烯利处理果实对基因表达的影响。在不同组织器官中,MdHB-1在花瓣中表达量较高,而MdACO1在成熟果中表达量较高。在果实不同发育阶段中MdHB-1在未成熟果中（盛花期40 d后）表达量最高,MdACO1在成熟果中尤其是花后100 d表达量最高。外源乙烯利（500 mg/L）处理的果实放置0～1 d时抑制MdHB-1的表达,但在7 d后其表达量增高;MdACO1表达量在外源乙烯利处理后迅速升高,并随着放置时间的延长而大幅度增高。转录因子MdHB-1可能参与了苹果幼嫩果实和花器官中其他相关基因表达的调控,这一过程似与MdACO1无关。MdACO1参与了果实的成熟过程,但并无受MdHB-1调控的迹象。外源乙烯会诱导成熟果实ACO1基因的过量表达,这一反馈调节过程似与MdHB-1无关。     

木糖发酵酵母Pichia stipitis木糖还原酶基因XYL1在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1。将该基因连入酵母表达载体pYX2 12的强启动子磷酸丙糖异构酶 (TPI)启动子下 ,得到融合表达载体pYX XYL1。通过电转化方法将 pYX XYL1转入酿酒酵母SaccharonmycescerevisiaeW 30 3-1A中 ,酶活测定表明 ,在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1得到活性表达 ,2酿酒酵母转化子粗酶液中木糖还原酶活分别为 0 .89U/mg(蛋白 )和 0 .83U/mg(蛋白 ) ,为供体菌的 1 5倍多。与基因供体菌不同 ,木糖还原酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导 ,为组成型表达。树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1的成功表达为后续的利用木糖的酿酒酵母菌株的构建奠定了基础     

Salicylic acid treatment enhances expression of chalcone isomerase gene and accumulation of corresponding flavonoids during fruit maturation of Lycium chinense

Chalcone isomerase (CHI) is a key gene involved in flavonoid biosynthesis, and flavonoids are important active ingredients in goji berries. Goji berry is a fruit with multi-nutrients consumed all over the world. Up to now, expression patterns of CHI gene and the regulation of flavonoid accumulation in goji berries still remain unknown. In this work, a CHI gene was cloned from fruits of Lycium chinense and was given the name LcCHI. Its relative expression and accumulation of total corresponding flavonoids during fruit maturation were investigated. During the fruit maturation, the expression of LcCHI gene increased gradually, and the accumulation of total flavonoids showed an overall upward trend. This study also showed that the expression of LcCHI gene and the content of total flavonoids in the goji berries could be up-regulated by exogenous salicylic acid (SA) treatment. A reactive oxygen species-dependent signaling pathway was suggested to be involved in this process. This research showed that the expression of LcCHI gene was positively correlated with total flavonoid accumulation and the regulation of them by SA could be a potential approach to produce more desired and valuable flavonoids in goji berries.     

Purification and Properties of Xylose Isomerase of Streptomyces coelicolor A3 (2)

The xylose isomerase of Streptomyces coelicolor A3 (2) was purified by conventional techniques to apparent homogeneity. The relative molecular mass of the sub-unit of the enzyme was determined as 40kDa and the enzyme is composed of 4 such sub-units. Significantly, the enzyme is optimally active at pH 7.0 and at 70°C, and requires only magnesium as cofactor. Presence of magnesium considerably minimizes inhibition of the enzyme by calcium. These considerations suggest that the present enzyme is more ideal for application in high fructose syrup process. The enzyme has Km = 0.041 M for xylose and 0.2 M for glucose with the corresponding V_max values being 58.4 and 9.09 mol. min⁻¹ mg⁻¹. Among the various amino acid modifying reagents, acetic anhydride and ethyl dimethyl amino propyl carbodiimide showed the most pronounced effects of reduction and enhancement of catalysis respectively.     

密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆及其表达条件的优化

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA 表达载体,并转化至E. coli BL21 (DE3),经异丙基-β -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE 电泳。结果表明,融合蛋白分子质量约为45kD。在诱导时间9h、0.6mmol/L IPTG、30℃和OD600nm 值为0.8 的最适培养条件下,酶比活力最高达到62.42U/mL。     

芹菜过敏原蛋白Api g1.02的克隆、表达及单抗制备

提取芹菜总RNA,反转录PCR(RT-PCR)扩增出过敏原蛋白Apig1.02基因,经PCR、酶切和序列测定后,得到重组质粒pET-32a-Apig1.02。将重组质粒转化到BL21(DE3)pLys感受态细胞中,用1mmol/L异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)对转化菌进行诱导表达及SDS-PAGE分析后,将表达蛋白提取纯化,制备单克隆抗体并进行Western blot分析。结果表明芹菜过敏原蛋白Apig1.02在体外获得了高效表达,表达融合蛋白分子质量约35ku,诱导6h后表达量最高,占菌体总蛋白的40%左右;制备的单克隆抗体能与表达蛋白发生免疫印迹反应,说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。该研究结果为建立芹菜过敏原蛋白的免疫学检测方法奠定了基础。