樱桃谷鸭胸肉脂肪氧合酶的分离纯化及其酶学特性研究

用硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sepharose柱层析法分离纯化樱桃谷鸭胸肉中脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX),同时对酶学性质进行研究。结果显示：在DEAE-Sepharose柱层析时,当NaCl洗脱浓度在0.3～0.35mmol/L时,LOX被分离出,LOX经过分离纯化后其纯化倍数可达到54.3,SDS-PAGE电泳显示其分子质量约为96kD;粗酶和纯酶性质略有不同;以亚油酸为底物,粗酶和纯酶的最适底物浓度分别为6.4、10mmol/L,最适反应温度分别为40、30℃,最适pH值分别是5.0、5.5;纯酶Km=1.139mmol/L、Vmax=0.07608U/min,纯酶与底物的亲和能力大于粗酶。     

南美白对虾血淋巴脂肪氧合酶的分离纯化及其生化特性研究

用羟基磷灰石柱层析法分离纯化南美白对虾血淋巴脂肪氧合酶,同时进行酶学性质及其反应产物研究,为南美白对虾资源的综合利用、虾风味形成机制的研究提供依据。结果显示:以亚油酸为底物,南美白对虾血淋巴脂肪氧合酶最适温度为25℃,最适pH9.6,最适底物浓度0.25mmol/L,Vmax值为1.67×103U/mg蛋白·min,Km值为0.5mmol/L,1mmol/L的谷胱苷肽能有效提高酶液稳定性;该酶对3种不饱和脂肪酸的亲和力依次为C20∶4>C18∶2>C18∶3;利用正相高效液相色谱分析,南美白对虾血淋巴脂肪氧合酶催化亚油酸甲酯只形成13-氢过氧化物。     

小球藻脂肪氧合酶酶学性质研究

从小球藻中提取脂肪氧合酶,并对其酶学性质进行研究.结果表明,以亚油酸为底物,小球藻脂肪氧合酶的最适pH为7.6和9.4,最适作用温度为35℃,Km为104.18mmol/L,Vmax为4.12μmol/min·mg蛋白质,脂肪氧合酶对热不稳定,60℃下处理1h后,活性基本丧失,5mmol/L EDTA可有效抑制酶活,在透析过程中添加0.2mmol/L Ca2+可增强脂肪氧合酶的稳定性.     

鲜食玉米脂氧合酶的酶学性质

本实验研究鲜食玉米脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的酶学性质。以新鲜甜玉米、糯玉米籽粒及其胚为试材,采用紫外分光光度法,以亚油酸为底物,探讨了酶提取部位、酶促反应温度、pH值及底物浓度对LOX活性的影响。结果表明,鲜食玉米胚中LOX活性显著高于鲜食玉米籽粒,其最适反应温度为55℃,最适反应pH值为6.0,最适底物浓度为8.0mmol/L,提高温度和延长处理时间能有效地钝化LOX。     

重组葡萄糖脱氢酶酶学性质研究

葡萄糖脱氢酶可用于高纯度低聚果糖和葡萄糖酸钙的生产，一种重组葡萄糖脱氢酶表达、纯化后，对该酶酶学性质进行了研究。最适反应pH值8．4，最适反应温度37℃，在温度低于45℃条件下，酶活力稳定性好。在最适温度和pH条件下，以葡萄糖为底物时葡萄糖脱氢酶的米氏常数Km=20．09mmol／L，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）为底物时的米氏常数Km=0．10mmol／L。     

鲜枣脂氧合酶酶学特性及热失活动力学研究

以亚油酸为底物,采用紫外分光光度法测定鲜枣脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的酶学特性及热失活动力学性质。考察了温度、p H、金属离子及络合物对LOX活性的影响,并建立了LOX酶促反应动力学及热失活动力学参数。结果表明:鲜枣LOX的最大吸收波长为265 nm;最适温度和p H分别为40℃、7.0;在p H值为5.0~6.0的环境中,LOX活性保持相对稳定;酶促反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学,其Km和Vmax分别为0.14 mmol/L、0.26 U/min,鲜枣LOX与底物亚油酸的亲和力较好;且LOX的热失活遵循一级反应动力学规律,反应活化能为105.20 k J/mol;2 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Cu2+、Ca2+、Mn2+对LOX酶活力有激活作用(P0.05),而2 mmol/L Mn2+、Zn2+、Mg2+和10 mmol/L Mg2+,EDTA对LOX活性具有抑制作用(P0.05)。该试验为鲜枣加工贮藏中LOX活性控制提供了有益的数据参考。     

米糠脂肪氧化酶活力的快速测定及其酶学特性研究

紫外分光光度法是测定脂肪氧化酶活力的常用方法,但其测定准确度受到底物溶液透明度和酶液纯度的制约,尤其在反应缓冲体系的pH低于7.0的条件下,难以进行粗酶液中LOX活力的直接测定。为克服现有方法的不足,本文建立一种改良的米糠中LOX紫外光谱检测方法。首先对米糠进行脱脂处理,提高方法的检测限与精确度;采用"磷酸盐溶液-亚油酸-吐温20"体系,简单、快速地获得透明的底物溶液;在获取米糠粗酶液LOX酶学特性的基础上,通过选择合适pH的缓冲体系,确保底物溶液的相对稳定;以"磷酸盐缓冲液+底物溶液+钝化的LOX溶液"为参比,省去繁杂的酶纯化步骤。结果表明:部分脱脂对米糠中脂肪氧化酶起到激活作用,其活力最高增加了46.33%;米糠LOX最适pH7.5,最适温度35℃;其活力测定的条件为:反应缓冲体系为2.0mL0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.5)、200μL底物溶液,其中亚油酸和吐温-20浓度分别是2.53×10-3mol/L、1.68×10-3mol/L,测定温度25℃。此优化条件下,粗酶液添加量在10～40μL范围,反应速率与酶浓度呈正比,△OD234/min=0.001V-0.0026(R2=0.9996);米糠LOX酶促反应最大速率Vmax=0.136△A/min,米氏常量Km=11.592×10-3mol/L。该方法能简便、快速和准确地进行米糠中LOX的活力测定以及酶钝化动力学研究。     

大豆脂肪氧合酶的分离纯化及其性质研究

研究了从大豆种子中分离、纯化大豆脂肪氧合酶的方法,研究表明经过缓冲液提取、差速离心、盐析沉淀和离子交换层析可以得到电泳纯级的大豆脂肪氧合酶。特性研究表明大豆脂肪氧合酶的最适pH为9,在较低温度下酶活能保持较高水平,用双倒数法求得大豆中脂肪氧合酶Km=80.6μmol/L,Vmax=54.2μmol/(L·min)。     

大豆脂肪氧合酶的提取纯化及其特性研究

本实验以大豆为原料,经硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶柱G200分离沉淀,得到2种脂肪氧合酶（L0x）：LOX．1,LOX．2。对这两种同工酶的部分特性进行研究。其中LOX-1的反应最适pH为7．0,在pH9．0时无活性。而LOX-2最适pH为9．0,在pH7．0时也表现出较强活性。最适温度均为25℃。两种同工酶的热稳定性结果表明,LOX．1和LOX．2在40℃活性稳定,加热温度高于50℃时,活性急剧下降。在亚油酸为底物的反应体系中,LOX．1和LOX．2的K。值分别为8．2、12．2mmol／L。并对Ca2＋、Na＋、Cu2＋、和Fe3＋等不同的金属离子表现出不同的反应活性。     

麻鸭脂肪氧合酶的分离纯化及其性质研究

采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶色谱等方法对麻鸭脂肪氧合酶(Shelduck Lipoxygenase)进行了纯化。结果显示,麻鸭LOX粗提液经60%⁸0%硫酸铵沉淀、DEAE离子交换层析、Superdex75凝胶过滤、SOURCE15Q离子交换层析后可达电泳纯,麻鸭LOX比活力为85714.3U/mg,纯化倍数98.64,经SDS PAGE分析麻鸭LOX的分子质量约为62 kDa。麻鸭LOX与大豆LOX的酶学性质差异较大,麻鸭LOX的最适温度为30℃,最适pH为6.0,且热稳定性和pH稳定性均优于大豆LOX。同时,Zn2+、Ca2+对麻鸭LOX的激活作用明显,而Mn2+对麻鸭LOX具有强烈的抑制作用。     

白丝北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析

为实现从L-谷氨酸到α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid,α-KG）的高效生物转化,将来源于白丝北里孢菌（Kitasatospora setae KM-6054）的L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase,LGOX）在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现异源表达,并研究其酶学特性。根据LGOX的氨基酸序列和大肠杆菌系统偏好性合成LGOX全基因序列,并通过pET28a（＋）/DE3系统在大肠杆菌中实现了功能表达。诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）终浓度为0.1?mmol/L,20?℃诱导18?h,重组大肠杆菌粗酶液酶活力可达49.10?U/mL。亲和层析获得酶比活力为45.98?U/mg纯酶,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳条带显示蛋白分子质量大小约为70?kDa。酶学性质研究表明：其最适反应温度和pH值分别为40?℃和6.0;Km值为1.23?mmol/L,Vmax值为76.24?μmol/（min·mg）,L-谷氨酸为该酶的最适底物。本研究确定了LGOX在E.?coli?BL21中的异源表达及酶学特性,为生物转化合成α-KG提供了新的参考途径。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

重组融合蛋白MBP-PAI的表达、纯化及酶活测定

为了解决亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase,PAI)在大肠杆菌中形成包涵体的问题,选择麦芽糖结合蛋白(Maltose-Binding Protein,MBP)标签和低温诱导表达系统pColdV,构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli BL21(pCold-Mpai),并对其诱导表达条件进行了优化。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白MBP-PAI成功表达,重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导温度15℃、IPTG添加量0.1 mmol/L、诱导时间12 h,在该诱导条件下,与未融合MBP的PAI相比,MBP-PAI的可溶性表达量为后者的18倍、酶活为后者的1.5倍。经过MBPTrap HP亲和层析柱纯化后,MBP-PAI纯蛋白质的比酶活为1.58 U/mg,能够转化亚油酸形成反10,顺12-共轭亚油酸。     

重组猪羧肽酶B的酶学性质及稳定性研究

目的研究重组猪羧肽酶B的酶学性质及稳定性。方法测定其酶学动力学参数Km和Vmax,最适pH和最适温度;研究不同pH和不同温度条件下酶的稳定性,以及金属离子和EDTA对酶的活性与稳定性的影响。结果重组猪羧肽酶B的Km为0.27 mmol/L,Vmax为222.22μmol/min,最适pH为7.65,最适催化温度为25℃;pH在5.0~9.0范围内,温度在4~30℃稳定性良好,Cu2+和EDTA抑制酶活性,Co2+促进酶活性。结论重组猪羧肽酶B的酶学性质与报道的提取猪羧肽酶B的性质基本相同,pH5.0~9.0范围内稳定,在4~30℃时稳定性好。     

α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,成功异源表达了一株链球菌（Streptococcus）S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中（pH 7.5～10.0）及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的最大水解速率（Vmax）为508.38 μmol/（min·mg）,米氏常数（Km）值为1.2 mmol/L;通过薄层层析（TLC）法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。     

褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质

作者从蜡样芽孢杆菌F1-5-10中提取DNA,通过PCR克隆得到褐藻胶裂解酶基因后,将其构建到pET-30a(+)上并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达,继而对纯化得到的褐藻胶裂解酶蛋白进行活性检测和酶学特性研究。实验结果表明:PCR扩增出1035bp大小的褐藻胶裂解酶基因algl(GenBank登录号:GU585575),SDS-PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为45 000的特异性蛋白质条带。表达条件优化实验结果表明0.4mmol/L浓度的IPTG 32℃诱导4h重组蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白质质量的36%。测定褐藻胶裂解酶酶活性,酶活力为11.7U/mg。酶学性质研究表明:ALGL的酶活最适温度为35℃,热稳定性较差,最适pH值为6.6,Ca2+、Mg2对酶活有激活作用,ALGL催化褐藻胶的Km值为1.89mg/mL,Vmax为15.01U/mL。     

重组水稻 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

对重组水稻α- 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD;最适酶反应温度为45℃,最适pH 值为5.0;酶活力在0～20℃,pH4.0～7.0 最为稳定;酶学动力学常数Km 为0.78mmol/L,Vmax 为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响,Hg2+、Ag+及－ SH 基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。     

乳酸片球菌AS1.2696来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质分析

克隆表达乳酸片球菌AS1.2696菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质。分析乳酸片球菌AS1.2696菌株的全基因组序列,聚合酶链式反应扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-prha2和pSE-prha3,在大肠杆菌Escherichia coli XL-blue进行表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究重组酶PRHA2、PRHA3的酶学性质。结果表明,重组酶PRHA2的最适pH值和温度分别为5.0和60?℃,Km值为（3.039±0.581）mmol/L,Vmax值为（2.032±0.186）μmol/（min·mg）;PRHA3的最适pH值和温度分别为5.5和45?℃,Km值为（2.797±0.132）mmol/L,Vmax?值为（113.35±1.485）μmol/（min·mg）。PRHA2和PRHA3能够水解人工底物对硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR）以及α-1,6键的橙皮苷、芦丁;PRHA2对4-硝基苯基-β-D-阿拉伯糖苷（4-nitrophenyl-β-L-arabinoside,pNPA）有一定的水解活性;PRHA3对淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C这几种物质C-7位的葡萄糖糖苷键有较弱的水解作用。此外,PRHA3能够水解朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha连接的外侧的鼠李糖苷键,在食品及医疗方面具有一定的应用价值。