高压热杀菌处理对枯草杆菌芽孢皮层裂解酶活力的影响

高压热杀菌处理(HPTS)下芽孢皮层肽聚糖水解是造成细菌芽孢死亡的重要原因,芽孢自身皮层裂解酶活力变化对皮层肽聚糖水解有直接影响。本文从枯草杆菌芽孢中提取了皮层裂解酶,先研究了磷酸钠浓度、pH、温度和压力对皮层裂解酶活力的影响,在此基础上研究了HPTS对该酶活力的影响。结果发现,皮层裂解酶的最适磷酸钠浓度为0.05 mol/L,当磷酸钠浓度为0.35 mol/L 时,皮层裂解酶活力较低;当pH为7时,皮层裂解酶活力最强,偏酸或偏碱性条件下,活力均有所降低;在4~44 ℃时皮层裂解酶均具活力,酶活变化无明显规律,但当温度升至68 ℃时皮层裂解酶基本失活;在150~530 MPa压力范围内,压力对皮层裂解酶活性基本无影响,然而HPTS处理时(530 MPa、68 ℃、15 min),皮层裂解酶基本失活,而皮层裂解酶是芽孢中唯一能特异性地水解皮层肽聚糖的酶,由此可推测HPTS处理下皮层肽聚糖发生了非酶水解。     

枯草杆菌芽孢皮层肽聚糖的提取与结构分析

高压热杀菌技术(HPTS)是一种重要的杀菌技术,研究细菌芽孢皮层肽聚糖的结构对阐明HPTS处理下皮层肽聚糖的水解机制及芽孢失活机制有重要意义。从枯草杆菌芽孢中分离提纯出皮层肽聚糖,研究其组成及结构。经红外光谱分析发现提取物具有肽聚糖的典型结构特征,研究发现变溶菌素比溶菌酶更充分地水解了肽聚糖,测定了水解物中肽聚糖骨架主要成分N-乙酰葡糖胺的含量,并用HPLC法测定了肽聚糖水解物中各种氨基酸的含量,研究发现细菌芽孢皮层肽聚糖中氨基酸含量显著高于细菌营养体细胞壁肽聚糖中的氨基酸含量,这种组分含量和结构上的不同很可能是造成皮层肽聚糖独特性质的原因。     

芽孢皮层裂解酶的提取与SDS-PAGE分析

使用2,6-吡啶二羧酸(DPA)、L-丙氨酸、肌苷等诱导芽孢萌发,从萌发液中提取芽孢皮层裂解酶。提取的芽孢皮层裂解酶经超滤浓缩后进行SDS-PAGE垂直板电泳分析。研究发现:DPA、L-丙氨酸、肌苷以及L-丙氨酸结合肌苷对枯草芽孢杆菌芽孢均有诱导萌发的作用,且DPA诱导枯草芽孢杆菌芽孢萌发效果最好。进行SDS-PAGE电泳时,进样量为15μL,分离胶浓度为10%的凝胶板跑出的蛋白条带分离的较好,凝胶板上有4条蛋白条带,通过蛋白质分子量标准曲线可得出,目标蛋白分子量大约分别为:61.10、48.64、43.25、31.28 k Da。本研究初步提取纯化了皮层裂解酶,为后继进一步提纯皮层裂解酶、研究HPTS对该酶活性和结构的影响提供试验材料,有助于阐明高压热处理下芽孢死亡的机理,推动HPTS技术在食品工业中的应用。     

枯草芽孢杆菌芽孢皮层裂解酶CwlJ基因的克隆及酶生物信息学分析

高压热杀菌（HPTS）技术是一种重要的食品杀菌技术,能有效杀灭细菌芽孢。分离纯化出芽孢皮层裂解酶CwlJ可用于研究HPTS杀灭芽孢的机理。通过基因克隆得到了皮层裂解酶基因CwlJ,并构建了表达载体pET-28a(+)-CwlJ。结果表明,CwlJ基因大小为440 bp,编码142个氨基酸;生物信息学分析表明,皮层裂解酶CwlJ为亲水性的碱性不稳定蛋白;皮层裂解酶CwlJ中α-螺旋占26.06%,β-延伸链占21.83%,β-转角占4.93%,无规则卷曲占47.18%;不是分泌性蛋白,形成包涵体的可能性为68.11%;与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）Bt18247的同类酶CwlJ亲缘关系最近。该研究为后续皮层裂解酶CwlJ基因的表达、分离纯化以及阐明HPTS下皮层肽聚糖水解机制奠定了理论基础。     

短短芽孢杆菌几丁质酶的分离纯化及酶学性质

探讨来源于短短芽孢杆菌FM4B的几丁质酶（chitinase）分离纯化过程及其性质。菌株FM4B摇瓶发酵液经过离心、乙醇分级沉淀及葡聚糖凝胶G-100层析纯化,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定其分子质量。结果获得几丁质酶纯品,酶的纯化倍数为7.19,酶活回收率为30.6%,分子质量为66 kD;酶活力在pH 5.0～9.0和80 ℃以下稳定,最适pH值为6.0,最适温度为50 ℃;Cu2+、Hg2+、Pb2+、Co2+以及Zn2+对该酶有强烈的抑制作用,Mg2+ 和Ca2+对该酶的活力具有一定的促进作用;该几丁质酶对多种霉菌有显著的抑菌效果。菌株FM4B分泌的几丁质酶稳定性好,且对多种霉菌抑制效果明显,具有较高的潜在利用价值。     

坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶的纯化以及酶学性质

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-50凝胶过滤、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）xy-7发酵液进行分离纯化,获得纯化的木聚糖酶,纯化倍数为26.36,酶活回收率为5.13%。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果为单一条带,分子质量为24.5 ku。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为8.0。K+、Fe2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+对酶有强烈的抑制作用。以榉木木聚糖为底物时,米氏常数Km=4.733 mg/mL,最大酶反应速率Vm=315.85 μmol/（min·mg）。     

枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质

利用30%～70%饱和度的硫酸铵沉淀,Sephadex G-50凝胶过滤层析对浅盘发酵纳豆激酶进行分离纯化并对其酶学性质进行初步研究。以纤维平板法测定纳豆激酶活力,SDS-PAGE检验纯化效果。结果表明:纯化后纳豆激酶为电泳纯,分子质量约27.518kD,纯化倍数和酶活回收率分别为19和42.1%,纳豆激酶最适温度为50℃,最适宜pH值为8.0。     

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶的分离纯化及其酶学特性

巴氏葡萄球菌TS-82类胡萝卜素裂解酶经强阴离子柱、高效制备液相色谱和多肽分子筛纯化得到液相级纯酶(95.6%)。该酶比活力为125 U/g,纯化倍数为446,回收率为2.39%。纯化后的类胡萝卜素裂解酶经液相色谱-质谱联用测定,得其分子质量为655.093 D。关于酶学特性,研究发现该酶对C_(40)类胡萝卜素底物的最适温度为60℃,而作用于β-阿朴-8’-胡萝卜醛的最适温度是50℃,该酶的稳定温度为50℃以下;该酶对所测定底物的最适p H值为3.0;该酶与5种底物亲和力排列为:玉米黄质虾青素β-胡萝卜素角黄质β-阿朴-8’-胡萝卜醛;Al~(3+)和Fe~(3+)是该酶的强效催化剂,Fe~(2+)是该酶的强效抑制剂;H_2O_2在低浓度范围内(0~16 mmol/L)可促进酶活性;低体积分数乙醇(4%~16%)的添加对酶活性无明显抑制作用。结果表明该酶具有很好的耐酸性和热稳定性,能够适应果酒环境,为其工业化应用提供依据。     

解淀粉芽孢杆菌黄曲霉毒素B_1裂解酶的分离纯化及鉴定

解淀粉芽孢杆菌CGMCC-9021能够高效降解黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1,AFB_1),确定其降解AFB_1的活性蛋白及其机理是今后工业化生产应用的重要基础。通过硫酸铵分级沉淀、DEAE FF阴离子交换层析和Superdux 75凝胶过滤层析对解淀粉芽孢杆菌CGMCC-9021发酵液中降解AFB_1的活性物质进行分离纯化,通过Tricine-SDS-PAGE和质谱鉴定初步分析该活性蛋白为裂解酶(分子质量约27 ku)。同时,采用荧光色谱技术初步分析了裂解酶对AFB_1的降解机理可能是破坏AFB_1的内酯环结构。     

pH值对芽孢皮层裂解酶活性及结构的影响

为探究酸性pH值条件抑制芽孢萌发的机理,研究了不同pH值处理对芽孢皮层裂解酶(CwlJ)的活性和结构的影响。采用傅立叶红外光谱法与荧光光谱法来分析芽孢皮层裂解酶(CwlJ)的二、三级结构与酶的活性之间的关系。实验所采用的pH值为3、5、7、9、11,结果表明:1)p H值为3、5时,随着时间的推移,芽孢皮层裂解酶(CwlJ)被激活,活性很高;2)酶的活性与其二级结构域中的α-螺旋相对含量紧密相关;当pH值从3增加到5时,α-螺旋相对含量不断增大,由36.15%增加到37.29%,当pH值从5增加到7时,α-螺旋相对含量基本不变,当pH值从7增加到11时,α-螺旋相对含量不断的减小,即在pH值为3～5之间酶可能被激活;3)随着pH处理条件的改变,pH值为5的荧光强度最强,内部蛋白质完全展开,空间结构更加松散扩张,三级结构更加稳定。结果表明,在酸性pH值条件下,皮层裂解酶(CwlJ)的结构稳定,活性高,故推测酸对芽孢萌发的抑制作用不是因为其抑制了皮层裂解酶的活性。     

枯草杆菌溶栓酶的液体发酵工艺和分离纯化研究

以产溶栓酶的枯草芽孢杆菌SBS为出发菌株,采用单因子试验和正交试验研究了液体发酵培养条件和培养基组成对酶活性的影响.发酵液经硫酸铵分段盐析、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等手段得到了电泳纯级别的溶血栓酶.结果表明,产溶栓酶的最佳液体培养基组成为:10g/L米糠、25g/L大豆分离蛋白、0.2g/L CaCl2;最佳发酵培养条件为37℃,初始pH 8.0,15L发酵罐,发酵时间为70h,酶活性达到542U/mL,SDS-PAGE测得其分子量为32kDa.     

大麦芽极限糊精酶的分离纯化及酶学特性分析

将大麦芽提取的极限糊精酶粗酶液,利用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤色谱等分离方法对极限糊精酶进行逐步分离纯化。结果表明：纯化倍数为31.23,回收率为8.81%。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,图谱显示样品具有较高的纯度,分子质量约为97kD。同时研究了纯化前后极限糊精酶在不同作用环境下酶的活性变化,发现纯化后样品在温度45℃和pH 5.5左右具有最大酶活性,与粗酶液中酶活性相比具有明显差异。在体系中添加不同浓度的金属离子,结果发现,Mg2+、Ca2+、Mn2+在浓度较低时,对酶活性具有激活作用,而浓度较高时,则具有抑制作用;整体上,K+对酶活性影响不大;Zn2+、Fe2+对酶活性具有抑制作用。     

巨大芽孢杆菌产胞外核糖核酸酶的分离纯化及部分酶学性质研究

巨大芽孢杆菌发酵液经硫酸铵沉淀、CM-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析,纯化得到核糖核酸酶电泳纯品,并对其性质进行研究。该酶比活力为54272.27U/mg,回收率为11.37%,纯化倍数为606.67倍。该酶分子质量约为33.3kD,最适温度为52.5℃,最适pH值为8.5,在20～40℃以及pH6.0～7.0范围内稳定性较好。Fe2+、Cu2+、SDS、抗坏血酸和草酸对该酶活性有抑制作用。     

黑曲霉菊粉酶的分离纯化与酶学特性

黑曲霉（Asperginusniger）105发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤,得到菊粉酶组分,纯化倍数为7．73倍,活力回收率为4．39％。该菊粉酶的最适pH值为6．0,最适温度为50℃,Cu^2＋、Mn^2＋、Zn^2＋、Fe^2＋对该酶有很强的抑制作用。菊粉酶活力与蔗糖酶活力之比为16．5,表现为内切酶活性。以菊粉为底物时,米氏常数（Kin）为0．1999 mmol／L,最大反应速度（Vmax）为117．32μmol／（mg·min）。     

黄瓜过氧化物酶的分离纯化及酶学性质

新鲜的黄瓜经匀浆、抽提、硫酸铵沉淀、CM-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶。该酶的比活力、回收率及纯化倍数分别为64 177.67 U/mg、9.58%、61.93。该酶的分子质量为41.15 kD,亚基分子质量为40.21 kD。该酶的最适温度和最适pH值分别为60 ℃和6。在25～45 ℃及pH 5～9的范围内非常的稳定。在测定条件下测得该酶的Km值为53.79 mmol/L。硫氰化钾对该酶活力基本无影响。尿素、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+对该酶都具有激活作用且浓度至50 mmol/L时酶活力分别被激活至112%、127%、113%、128%、139%、199%、348%,然而十二烷基磺酸钠、抗坏血酸和草酸对该酶有强烈的抑制作用;Zn2+、甲醇、乙醇和异丙醇对该酶有一定的抑制作用。     

普鲁兰酶的分离纯化及部分酶学性质

对盐球菌(Halococcus sp.)Z1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产的普鲁兰酶粗酶液的耐热耐酸性进行了比较研究,并采用(NH4)2SO4盐析、透析、DEAE-Sephadex A25阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤对Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶进行分离纯化,并测定了其部分酶学性质。结果表明Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶在低于65℃和pH4.0~7.5范围内有很好的稳定性,最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0~5.4,相对分子质量为8.17×104,Km值为0.24 mg/mL。     

蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质测定

大蒜中功能成分含硫化合物是由蒜氨酸酶(alliinase,E C4.4.1.4)催化蒜氨酸(alliin)生成的。本实验通过提取、盐析、透析及层析,自新鲜大蒜中分离纯化出蒜氨酸酶,并测定了蒜氨酸酶的酶学性质。蒜氨酸酶的适宜分离纯化过程及条件为:pH7.0Na /K 磷酸缓冲液提取,45%饱和度NH4(SO4)2盐析,10000×g离心沉淀30min,pH6.5的Na /K 磷酸缓冲液溶解,截留1.4万分子量透析袋透析,Sephadex G-200层析,收集洗脱时间4.75h的洗脱液。蒜氨酸酶最适温度和pH值分别为30℃和6.3,Mg2 、Zn2 、Fe2 、Fe3 、EDTA-Na金属离子对蒜氨酸酶有激活作用,Fe3 激活作用最明显,Cu2 严重抑制蒜氨酸酶活性。以合成S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜为底物,蒜氨酸酶的Km为5.91mmol/L、Vmax为1.55μmol/min。     

中温结合乙醇处理对枯草芽孢杆菌芽孢皮层裂解酶活性及结构的影响

以枯草芽孢杆菌芽孢皮层裂解酶为研究对象,研究中温结合乙醇处理对其活性及结构的影响。采用紫外可见分光光度法测定酶活性,荧光光谱和傅立叶变换红外光谱法(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)分析处理前后酶二三级结构的变化。结果表明,80℃结合体积分数为30%、75%乙醇处理20 min时,杀灭芽孢效果最佳,皮层裂解酶活性最弱,仅为(24. 3±2. 73)、(20. 42±2. 17) U/L。中温结合乙醇处理使皮层裂解酶荧光强度下降,80℃时红移3 nm,三级结构发生变化。随着温度和乙醇体积分数逐渐增加,二级结构发生变化,α-螺旋及β-折叠含量减少、无规卷曲含量显著增加,75%(体积分数)乙醇80℃处理时变化最显著,含量分别为(10. 98±0. 03)%、(25. 41±0. 03)%、(48. 24±0. 06)%、(15. 37±0. 02)%。中温结合乙醇处理后皮层裂解酶结构发生变化,从而导致酶活力的改变。     

金银花过氧化物酶的三相分离纯化及酶学性质

采用三相分离法提取纯化金银花中过氧化物酶,结果表明最优纯化条件为pH?5.60、硫酸铵质量浓度39.49?g/100?mL、提取液与叔丁醇体积比1∶1.38,在该条件下纯化倍数为5.849,回收率为87.64%。金银花过氧化物酶比活力为1 021.6 U/mg,色素清除率为92%;酶学性质研究表明:金银花过氧化物酶最适温度为30℃,热稳定范围为10~40℃;最适pH值为5,pH值稳定范围为4~7。在金银花过氧化物酶催化的双底物酶促反应中,当H_2O_2浓度一定时,酶对愈创木酚的Km值为8.12?mmol/L,vmax值为1.71?mmol/(min·L)。当愈创木酚浓度一定时,H_2O_2的Km值为0.822?mmol/L,vmax值为1.38?mmol/(min·L)。金银花过氧化物酶与底物的亲和力由强到弱依次是邻苯三酚、邻苯二酚、联甲氧基苯胺、愈创木酚。Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)对金银花过氧化物酶有激活作用,Mg~(2+)、Mn~(2+)、柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、十二烷基磺酸钠对金银花过氧化物酶有不同程度的抑制作用。     

香葱中蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质

对香葱中蒜氨酸酶进行分离纯化并研究其酶学性质。通过均浆、离心、硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52离子交换层析和Sephadex G200凝胶过滤层析技术分离纯化得到纯度较高的蒜氨酸酶,并利用SDS-PAGE电泳对其纯度进行鉴定。结果表明,经分离纯化可得纯化倍数为19.6倍的蒜氨酸酶,酶比活力为11.44U/mg,酶活回收率为32.1%,达到电泳纯,其亚基的分子质量约为54.5ku。纯酶的最适反应温度为45℃,最适pH7.0,以S-甲基-L-半胱氨酸亚砜为底物,蒜氨酸酶的Km为45.31mmol/L,Vmax为40.32μmol/(mg·min)。