体外连续传代培养对生物工程细胞CHO凋亡的影响

采用Annexin V-FITC/PI双染法检测磷脂酰丝氨酸外翻、JC-1染色法检测线粒体膜电位、底物切割法检测Caspase-3及Caspase-8酶活性等4个指标来评估连续传代培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的凋亡情况。结果表明,随着连续传代培养代次的增加,CHO细胞发生内部凋亡途径介导的凋亡,同时对凋亡诱导剂的反应更为敏感。因此,可以采用凋亡指标来监测细胞状态,从而提高基因工程蛋白的生产效率及化学品毒理学评价的准确性。     

hMDHⅡ过表达抑制过氧化氢压力下的CHO细胞凋亡

构建人苹果酸脱氢酶Ⅱ(hMDHⅡ)过表达的重组CHO细胞,并研究hMDHⅡ过表达对过氧化氢压力下CHO细胞凋亡的影响。结果显示,在0.1mmol·L-1过氧化氢压力下,hMDHⅡ过表达明显提高了补料分批培养后期细胞活率。线粒体膜电位及活性氧检测显示,hMDHⅡ过表达后线粒体膜电位显著提高、活性氧显著降低,表明hMDHⅡ过表达抑制细胞凋亡可能是通过减少细胞内活性氧而实现的。     

酵母浸出物FP103对CHO细胞生长的影响

目的探讨安琪酵母浸出物FP103对CHO细胞生长的影响。方法分别采用含3、1、0.125 g/L酵母浸出物FP103的DMEM/F12培养基(含1%FBS)培养CHO细胞,CCK-8法检测细胞生长情况。另将酵母浸出物FP103与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)联合加入DMEM/F12培养基(含0.5%FBS)中,用其培养CHO细胞,CCK-8法检测细胞生长情况,显微镜下观察CHO细胞形态。结果 1 g/L的酵母浸出物FP103可明显促进CHO细胞的生长(P <0.05)。酵母浸出物FP103与EGF联用可有效促进CHO细胞在低血清浓度下正常生长,且细胞形态正常,未见细胞悬浮不贴壁现象。结论酵母浸出物FP103可替代部分血清,为CHO细胞的生长提供所需营养。     

CHO细胞连续传代培养对细胞毒性试验结果的影响

研究了CHO细胞连续传代培养对细胞毒性试验结果的影响。对不同代次CHO细胞形态进行观察,并利用中性红比色法、MTT比色法检测同种受试物对不同代次CHO细胞的抑制率是否有显著差异。结果表明：随着细胞代次的升高,细胞的形态、胞浆折光性、边界、排列均发生了改变;同种受试物对CHO细胞的抑制率随细胞代次的升高呈上升趋势;中性红比色法较MTT比色法对细胞的衰老更灵敏。为了提高细胞毒性试验结果的可重复性以及可比性,细胞代次是需要控制的重要因素。     

狂犬病毒aG株糖蛋白在CHO细胞中的表达

目的克隆狂犬病毒aG株糖蛋白(Glycoprotein)基因,构建重组真核表达载体,在CHO细胞中表达aG株糖蛋白。方法采用RTPCR,从狂犬病毒aG株基因组RNA中扩增GP基因,并将该基因克隆至真核表达载体pCIdhfr上,以脂质体介导法转染CHOdhfr-细胞。用MTX筛选的抗性克隆经ELISA、免疫荧光及Westernblot检测GP蛋白的表达。结果克隆到狂犬病毒aG株糖蛋白全长基因,并在CHO细胞中进行表达。结论成功地在CHO细胞中表达了狂犬病毒aG株的糖蛋白,为进一步开发狂犬病毒基因工程疫苗打下基础。     

乳酸对重组CHO细胞生长代谢及EPO表达的影响

利用脉冲实验方法研究了乳酸和渗透压对重组CHO细胞生长代谢和EPO表达的影响 ,证明乳酸分子本身对重组CHO细胞的生长代谢和产物表达没有明显的影响 .乳酸浓度从 0增加到 6 9mmol·L^-1对应于渗透压从 30 0增加到 4 2 0mOsm ,细胞的比生长速率下降了 33% ,葡萄糖和谷氨酰胺的比消耗速率均增加了 2 3% ,细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的得率系数分别下降了 4 5 %和 4 7% ,乳酸的比生成速率则保持恒定 ,表明在高渗透压下营养物的利用更倾向于能量代谢过程 ,好氧能量代谢过程所占的比例随着渗透压的增加而增加 ;另一方面 ,氨对谷氨酰胺的得率系数增加了 4 4 % ,丙氨酸对谷氨酰胺的得率系数下降了 2 4 % ,表明谷氨酰胺经谷氨酸脱氢酶途径的代谢流量随着渗透压的增加而增加 .EPO的比生成速率随着渗透压的增加而下降     

抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)在CHO细胞表达

［摘 要］目的 开展基因重组AT-Ⅲ的研究，试将人AT-Ⅲ cDNA在CHO细胞中进行表达。方法 将携带AT-Ⅲ基因的表达载体转染CHO细胞，用 G418筛选抗性克隆，SDS－PACE与Western Blot检测其表达产物；并采用生化法测定AT-Ⅲ的表达量，采用凝血酶空斑法测定表达产物的活性。结果 Western Blot分析发现转移至膜上的表达产物能与抗AT-Ⅲ单克隆抗体结合，分子量与人血浆中AT-Ⅲ一致，证明在CHO细胞中成功地表达了AT-Ⅲ，并具有天然AT-Ⅲ的生物活性。结论 获得了表达AT-Ⅲ CHO细胞株。     

表达单克隆抗体的CHO细胞无蛋白培养基的优化

在自主研发无蛋白培养基的基础上,考察了氨基酸、维生素和葡萄糖对CHO细胞生长、代谢与抗体合成的影响。结果表明,对培养过程中消耗较多的氨基酸进行补充,虽然不能促进细胞生长,但有利于培养后期细胞活性维持与抗体合成;B族维生素的添加能促进细胞生长并延长培养时间;作为重要的碳源和能源,葡萄糖浓度较高时会抑制细胞生长,而浓度较低时不能有效支持细胞生长与抗体合成,维持其在适当浓度有利于细胞生长并能延长培养时间,从而有利于提高抗体产量。通过合理调整各营养物的浓度配比形成了优化的无蛋白培养基,CHO细胞在该培养基中的最高密度达到52.6×105cells mL 1,抗体产量达到274 mg L 1,与初始培养基相比分别提高了33%和63%。总之,在细胞培养过程中应维持充足且平衡的营养物成分,以有效供应细胞生长与抗体合成的需求。     

重组CHO细胞无血清培养基的研制

目的研制适合于重组CHO细胞生长的低成本无血清培养基。方法以无血清培养基SFM为基础,分别向其中加入不同的组分,包括水解物(0.8%大豆蛋白水解物、0.8%超滤植物蛋白栋、0.8%酵母提取物、0.8%谷类水解物、0.4%大豆蛋白水解物+0.4%酵母提取物)、激素(10μmol/L的地塞米松、氢化可的松)、脂类物质(0.05%脂肪乳剂、50 mg/L氯化胆碱、10 mmol/L磷脂酰胆碱),培养CHOK1细胞(表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白),检测不同添加物质对细胞密度、活力、蛋白表达量及蛋白中聚体含量的影响。结果添加大豆蛋白水解物和酵母提取物的混合物、地塞米松及脂肪乳剂可增加细胞密度,提高细胞活力,增加目的蛋白的表达量,降低蛋白中的聚体含量。结论通过对几种关键组分的优化,研制出适合于重组CHO细胞生长的低成本无血清培养基。     

应用载体介导的RNAi技术抑制HBsAg在重组CHO细胞中的表达

目的应用载体介导的RNA干扰技术,特异地干扰重组CHO细胞中乙型肝炎病毒s基因的表达。方法设计两段靶向HBV s基因的特异性siRNA,合成两对64nt寡核苷酸,插入载体H1启动子下游,构建表达干扰性发夹状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)的载体pHs-9和pHs-170,转染重组CHO细胞(该CHO细胞整合了HBV s基因,可稳定表达s抗原),用ELISA法检测HBsAg的表达。结果pHs-9和pHs-170转染重组CHO细胞后24~120h,在细胞培养上清中检测到HBsAg表达降低,抑制率均达到70%左右。结论pHs-9和pHs-170已成功地表达了发夹状siRNA,并抑制了重组CHO细胞中HBsAg的表达。     

无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞的比较

目的对无血清培养基与含血清培养基培养CHO细胞进行比较。方法应用两种培养基采用小方瓶培养CHO细胞,观察细胞维持时间、培养过程的形态变化及对血凝效价的影响。结果应用无血清培养基(A)培养CHO-C28细胞虽然可维持细胞正常生长,但贴壁不好,逐渐降低(A)加量情况可得到相应改善。结论 目前无血清培养基尚不能完全取代含血清培养基用于培养CHO细胞。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在CHO细胞中的稳定表达

目的在CHO细胞中稳定表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)。方法PCR扩增VZVgE完整胞外结构域编码基因,克隆至哺乳动物细胞表达质粒PSGHVO中,与DHFR选择性基因和脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选稳定分泌人生长激素(hGH)和gE融合蛋白的细胞株。采用ELISA和Western blot方法检测细胞培养上清中hGH和gE融合蛋白的表达,并用Ni2+-NTA柱进行纯化。结果gE基因PCR扩增产物和重组表达质粒PSGHVO-gE的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,均可见1500bp的目的基因条带。转染PSGHVO-gE质粒和DHFR基因的细胞培养上清液经ELISA和Western blot,确认有重组蛋白表达,gE表达量约为20mg/L;纯化后蛋白纯度约为90%。结论已在CHO细胞中稳定表达了VZVgE蛋白,为制备VZV表面抗原奠定了基础。     

表达IFNα2b-HSA融合蛋白的CHO细胞培养基优化及发酵放大

毕赤酵母表达的干扰素与白蛋白融合蛋白虽然避开了干扰素单体半衰期短的缺陷,但毕赤酵母对药物的糖基化修饰与人体的糖基化修饰差异性导致了药物的毒副作用。目前药物在CHO系统的表达得到了广泛应用。本研究室首次构建了能表达干扰素α2b和人血清白蛋白融合蛋白（IFNα2b-HSA）的CHO细胞株。在此基础上,本研究通过对12种国产商业化基础无血清培养基和5种流加培养基进行优化筛选,获得最适培养方案：基础培养基选择最适于生长的5号培养基（M2：M4=1：1）,流加培养基选择最有适于表达的F4培养基。在此基础上,进行5L生物反应器的发酵放大,pH为6.9～7.4,DO为40%～60%,细胞密度达到7.0×10⁶cells/mL时,温度由37℃降温至34℃,细胞活率降至80%时停止发酵,最终融合蛋白表达量达到137mg/L。初步实现了IFNα2b-HSA融合蛋白在CHO细胞中的高密度发酵。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在CHO细胞中的表达及其免疫学特性

目的在CHO细胞中表达Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus-2,HSV-2)糖蛋白D(Glycoprotein D,gD),并检测其免疫学特性。方法采用Vero细胞培养HSV-2,提取总DNA,以其为模板,PCR扩增gD基因,与pCMV-sport载体连接,构建重组表达质粒pCMV-gD,将质粒pCMV-gD转染COS-7和CHO-K1细胞,并进行表达。亲和胶Anti-flag M2 Agarose纯化表达蛋白,经SDS-PAGE和HPLC分析重组蛋白纯度,Western blot分析蛋白反应原性,全波长扫描分析蛋白的光谱曲线,等电聚焦电泳测定蛋白的等电点。以20、40μg纯化的gD免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清中HSV-2 gD特异性抗体水平,中和试验测定小鼠血清中和抗体水平。结果酶切鉴定及DNA测序表明,重组表达质粒pCMV-gD构建正确,在COS-7细胞的瞬时表达产物和CHO细胞中的稳定表达产物均可被HSV-2 gD单抗特异性识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。纯化的gD在相对分子质量约5 500处可见目的蛋白条带,纯度为65.46%;保留天然HSV-2 gD的反应原性,最适紫外吸收波长为275.50 nm,等电点为8.3。gD 20μg组和40μg组小鼠血清特异性抗体滴度分别为1∶125 000和1∶16 000,中和抗体滴度分别为1∶17和1∶16,表明gD可诱导中和抗体的产生,也可诱导高滴度的HSV-2gD特异性抗体。结论成功在CHO细胞中稳定表达了HSV-2 gD,表达的HSV-2 gD具有较好的免疫原性,为基因工程疫苗的开发奠定了基础。     

弱化二氢叶酸还原酶基因增进人神经生长因子β亚基在CHO细胞中的表达

目的通过弱化二氢叶酸还原酶基因(Dihydrofolate reductase,DHFR)增进人神经生长因子β亚基(β-Humannerve growth factor,β-hNGF)在CHO细胞中的表达。方法从质粒pUC18-β-NGF中扩增β-NGF基因,克隆至pMD18-T载体,构建克隆质粒β-hNGF/pMD18-T;经人工合成弱化SV40启动子与DHFR基因顺式表达元件,并插入pBudCE4.1质粒,构建质粒w-DHFR/pBudCE4.1;分别双酶切质粒β-hNGF/pMD18-T和w-DHFR/pBudCE4.1后连接,转化大肠杆菌Top10’,构建重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1,转染CHO-DHFR-后,筛选阳性细胞克隆,ELISA法检测阳性CHO细胞株表达β-NGF的水平,鸡背根神经节增殖法检测重组β-NGF的生物学活性。结果重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1经酶切和测序证明构建正确;共获得5株表达β-hNGF的CHO细胞株,且表达的β-NGF能使神经节出现明显的神经纤维,表达量为0.1μg/μl。结论通过弱化SV40启动子和DHFR基因,在CHO细胞中成功表达了β-hNGF基因,表达量增加且具有生物学活性。     

应用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞

目的采用国产激流式生物反应器培养表达HBsAg的重组CHO细胞。方法分别应用美国NBS公司的Celligen310型生物反应器和国产AP20SC型激流式生物反应器(单个细胞培养袋和4个细胞培养袋)连续灌流培养重组CHO细胞,连续培养35 d,每24 h收获1次,采用ELISA法测定细胞收获液中HBsAg的滴度。结果 Celligen 310型生物反应器培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续8 d,至第18天达最高水平(2.16μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.12μg/ml;国产AP20SC激流式生物反应器单个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续9 d,第18天达最高水平(2.20μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.08μg/ml,与Celligen 310型生物反应器相比,收液中HBsAg含量在2.0μg/ml水平持续时间无明显差异;国产AP20SC激流式生物反应器4个细胞培养袋培养重组CHO细胞分泌的HBsAg在2.0μg/ml水平上可持续13 d,与该生物反应器单个细胞培养袋相比明显延长,第21天达最高水平(2.14μg/ml),第35天收液中HBsAg含量为1.5μg/ml,明显高于单个细胞培养袋培养的细胞。结论国产AP20SC型激流式生物反应器可代替进口生物反应器对传代细胞进行大规模培养,用于人用疫苗的生产。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品的研制

目的制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力评价。方法选取检定合格的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)原液,经协作标定表面抗原蛋白含量后,加入氢氧化铝佐剂和冻干保护剂,冷冻干燥制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,并按《中国药典》三部(2010版)要求进行各项检定。经10次独立试验测定冻干参考品小鼠效力,采用Reed-Münch计算ED50值;将冻干参考品置4℃(8周)、37℃(4和8周)后分别检测疫苗效力,分析其稳定性,依据Q10法进行效期推测;并对2个生产企业10批疫苗进行效力测定,分析其适用性。结果制备的冻干参考品各项指标均符合规定,小鼠ED50均值为0.183μg,CV为50.5%;该CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg/ml,规格为10μg/0.5 ml;冻干保护剂、冻干工艺对乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力影响较小,冻干参考品在37℃放置不同时间,效力变化不明显,表明冻干参考品稳定性较好,有效期约为7年;10批疫苗中,不合格率为10%,表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力质控。结论制备的冻干参考品可作为重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力检定的质控参考品。     

康柏西普制品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的CHO细胞DNA残留量荧光定量PCR(Q-PCR)检测方法。方法采用DNeasy Tissue Kit提取CHO细胞基因组DNA,制备DNA标准品;确定Q-PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,并验证其专属性、准确性及精密性;用建立的方法对1003b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、1112b24批康柏西普原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果建立的标准曲线Ct值与模板DNA浓度的对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.99以上;检测HUVEC、HEK293细胞的DNA残留量均无特异性扩增曲线;检测高、中、低浓度的DNA标准品(105、103、101pg/ml)的平均回收率均在Q-PCR方法可接受的回收率范围(50%²00%)内,批间变异系数分别为9.3%、21.8%、26.8%;检测100pg/ml浓度的DNA标准品的平均回收率为111.6%,变异系数为20.4%;康柏西普原液的DNA残留量远低于100 pg/剂量。结论已成功建立特异的CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,该方法专属性好,准确性及精密性高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)免疫效果的观察

目的进一步观察重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫效果。方法选择江苏省响水县某中心小学学生及教师,经筛查HBsAg、antiHBs和antiHBc均为阴性的98名作为观察对象,使用10μg重组乙肝疫苗(CHO细胞),按0、1、6个月3针免疫程序进行免疫效果观察。结果全程免疫后1个月,85名学生中,抗HBs阳性83名,阳转率为97.65%,GMT为172.50mIU/ml,最高可达498.12mIU/ml。男性、女性的抗HBs阳转率分别为97.50%和97.78%,GMT分别为170.11和148.42mIU/ml。结论10μg重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)应用于小学生,免疫效果良好。     

抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因在CHO细胞中的表达

目的构建抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因,并在CHO细胞中表达。方法采用RT-PCR及RACE技术从鼠杂交瘤细胞克隆免疫球蛋白可变区基因,与人免疫球蛋白恒区基因拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因,转染CHO细胞并测定其表达量。结果构建的嵌合抗体基因在CHO细胞中的初始表达量为0.71μg/ml,亚克隆后表达量达0.95μg/ml。结论已成功构建抗人TNF-α嵌合抗体基因,并在CHO细胞中得到了高效表达。