肺炎克雷伯氏菌生物合成1,3-丙二醇的副产物调控研究

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 25955为原始菌株,利用代谢工程手段对K.pneumoniae生物合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的副产物进行调控.通过敲除副产物合成途径关键酶编码基因,在分批补料发酵条件下,1,3-PD的产量达到83.8 g·L-1,生产强度提至2.79 g·L-1·h-1;进一步结合乙酸吸收途径强化,有效解除了乙酸溢流现象,在分批补料发酵条件下,1,3-PD的产量达到94.9g·L-1,生产强度提至3.16 g·L-1·h-1.研究表明,通过敲除副产物合成途径关键酶编码基因结合乙酸吸收途径强化能够促进1,3-PD的合成,减少副产物的产生,提高K.pneu-moniae 代谢甘油合成1,3-PD的产量和生产强度.     

控制氮源浓度提高1,3-丙二醇的发酵水平

通过对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)甘油发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD)发酵过程的研究发现,氮源浓度对菌体生长、产物和副产物的代谢有着重要影响.氮源浓度较低时,菌体生长和产物生成都会因氮源不足受到影响;氮源浓度较高时会导致菌体过度生长和副产物的大量生成,降低1,3-PD的最终浓度和甘油到1,3-丙二醇的转化率.控制合适的氮源浓度可以提高1,3-PD的发酵水平,1,3-PD的最终浓度达到61.20 g·L-1、甘油到1,3-丙二醇的转化率达到0.72 (mol·mol-1),分别比对照提高了10%和20%.     

微生物发酵法1,3-丙二醇克雷伯氏菌的诱变育种

克雷伯氏菌是1,3-丙二醇(1,3-PD)生产菌。以产酸克雷伯氏菌2-1为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)诱变处理,运用质子自杀法选育,从含0.2 mol/L NaBr-NaBrO3的初筛平板上选出48株单菌落,然后结合培养基优化后的摇瓶发酵复筛,获得6个产酸突变株,其中Y-37具有较高的1,3-丙二醇转化率。经过初筛、复筛和传代实验,表明其是稳定的突变株。对菌株Y-37在自动发酵罐上进行批式发酵,结果显示:突变株产酸量大幅降低,而1,3-丙二醇的产量则显著增加。Y-37的1,3-丙二醇产量由出发菌株的10.67g/L升至18.23g/L。     

pH值对克雷伯氏肺炎杆菌发酵甘油产1,3-丙二醇的影响与控制

在克雷伯氏肺炎杆菌发酵甘油产1,3-丙二醇(1,3-PD)的过程中,不同的pH值控制对菌体生长、产物和副产物的生成有着重要的影响.通过对发酵过程中不同pH值控制下的代谢分析,发现pH值较低时菌体生长较慢,有利于副产物2,3-丁二醇的生成;pH值较高时菌体生长较快,有利于副产物乳酸的生成.通过两阶段pH值控制策略,即在发...     

甘油和木糖共发酵生产1,3-丙二醇的研究

以克雷伯氏肺炎杆菌代谢甘油为研究对象,采用木糖作为发酵过程中的辅助底物与甘油共发酵生产1,3-丙二醇,以解决甘油单耗过大的问题,并研究了甘油和木糖共发酵过程中相关代谢物浓度的变化规律。实验表明:克雷伯氏肺炎杆菌可利用D-木糖经过磷酸戊糖途径为菌体代谢提供大量的还原力(NADPH和NADH),促进1,3-丙二醇的合成。与甘油单独发酵相比,以木糖作为辅助底物的微氧批次补料发酵中,1,3-丙二醇的质量浓度、甘油转化率及产量分别提高了10.58%,21.11%和10.98%。共发酵生产1,3-丙二醇在降低甘油到1,3-丙二醇单耗的同时,还可以促进副产物的生成,为克雷伯氏菌发酵多联产工艺提供了可能,从而较全面地降低甘油发酵生产1,3-丙二醇工艺的技术成本,具有一定的研究意义。     

大气压冷等离子体诱变产1,3-丙二醇菌株Klebsiella pneumoniae

采用大气压冷等离子体介质阻挡放电法对产1,3-丙二醇的克雷伯氏菌进行诱变,采用诱变与筛选同时进行的单细胞平板诱变方法,同时获得了可耐受高浓度甘油且1,3-丙二醇产量较高的优良突变株. 对诱变后菌的间歇发酵结果表明,诱变菌株比出发菌株1,3-丙二醇的质量转化率提高了23%,对数期比生长速率提高了18%. 批式流加发酵过程中,1,3-PD浓度在发酵36 h时达到70.5 g/L,甘油的质量转化率为0.57 g/g,分别比野生菌提高47%和58%. 该诱变和筛选方法具有操作简单、效率高等特点,对具有工业应用价值的菌株筛选具有实用价值.     

克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶发酵条件研究

研究了克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶(甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶)的发酵条件。研究各种碳源、无机氮源、有机氮源及无机盐对产酶的影响,应用均匀设计、神经网络和遗传算法优化发酵培养基组成,结果为(gL-1):甘油30、KCl 1.6、NH4Cl 6.7、CaCl2 0.28、酵母浸膏2.8。在温度37C、初始pH 7.0、摇床转速200rmin-1和接种量5%条件下,发酵24h,无细胞抽提液中甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶活力(U·mg-1)分别为9.16、18.72、0.48,发酵34h,发酵液中1,3-丙二醇(1,3-PD)最大浓度为7.96gL-1。代谢过程中关键酶酶活与1,3-PD峰值出现时间不一致,且提早于1,3-PD峰值的出现。此外,结果表明优化后的培养基去除了多种微量元素,克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶可以在微氧条件下进行。     

克雷伯氏菌微氧发酵生产1,3-丙二醇的研究

对克雷伯氏菌在厌氧和通1.2L/min空气的条件下间歇连续发酵生产1,3-丙二醇进行了研究,在两种条件下1,3-丙二醇的转化率接近.在通空气的条件下细胞能够正常代谢,并获得较高菌体密度,但有氧发酵的生产强度高于厌氧发酵;甘油处于限制状态、稀释率为0.1h-1的连续发酵中,有氧发酵1,3-丙二醇的转化率和生产强度均高于厌氧发酵.     

固态发酵生产裂褶菌多糖的动力学研究

对固态发酵生产裂褶菌多糖的动力学过程进行了研究,基于Logistic方程和Luedeking-Pirct方程建立了裂褶菌固态发酵生成裂褶菌多糖的菌体生长、多糖合成和底物消耗的动力学模型,并对模型参数进行了非线性回归。结果表明,裂褶菌多糖的产量与菌体生长速率和底物消耗量均有关系,最大比生长速率为0.7385 d-1。模型预测值和实验值有良好的拟合性,菌体生长、多糖合成、底物消耗3条曲线的相关指数(R值)分别为0.99256、0.99163和0.98835。表明此动力学模型可以较好地定量描述裂褶菌多糖的固态发酵生产过程,对工业化生产具有实际指导意义。     

Z5-G菌生产聚β-羟基丁酸发酵动力学模型

研究了Z5 G菌株在 3L搅拌发酵罐中以蔗糖为碳源分批发酵生产聚β 羟基丁酸 (PHB)的生长特性。在Lo gistic方程和Luedeking Piret方程的基础上,建立了Z5 G菌发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物形成的动力学模型。应用MathCAD软件处理实验数据和模型,拟合出所有模型参数,建立了动力学模型,经过验证模型预测值和实验值吻合较好,表明此动力学模型对指导PHB的发酵生产具有实际意义。     

能量驱动对Klebsiella pneumoniae发酵甘油合成1,3-丙二醇的影响

考察了外加能量对Klebsiella pneumoniae合成1,3 丙二醇的影响,结果表明,外加0.6 0.8 g/L三磷酸腺苷 ATP 可以有效促进Klebsiella pneumoniae发酵甘油的还原代谢,1,3 丙二醇产量提高了50 70 ,得率在发酵后期仍能维持在较高水平. 利用休止细胞研究了甘油脱水酶催化失活后能量刺激复活的情况,结果表明外加三磷酸腺苷(ATP)对休止细胞中甘油脱水酶的复活有明显的驱动作用,经多次失活/驱动复活后甘油脱水酶活性可维持不变.     

若干因素对发酵法生产1,3-丙二醇的调控作用

利用一株新筛选的克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae ZJU 5205)对发酵法生产1,3-丙二醇进行了研究,考察了 pH、溶氧及添加辅助底物葡萄糖对发酵过程的调控作用。实验结果表明,相比于未调控 pH 发酵,恒定 pH 值发酵得到的菌体浓度明显增高,甘油消耗加快,1,3-丙二醇的最终浓度以及甘油到丙二醇的转化率(Y_(P/S))明显提高,分别达16.39g/L和0.51mol/mol;厌氧发酵时的菌体浓度和甘油消耗速率均高于微氧发酵,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率低于微氧发酵;添加葡萄糖为辅助底物能够有效促进菌体生长,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率却低于以甘油为单一底物时的发酵结果。     

外源添加ATP对K.pneumoniae菌体生长和产物合成的影响

基于K.pneumoniae生成1,3 丙二醇过程中甘油脱水酶催化失活与复活的特性,在发酵培养基中添加不同质量浓度的三磷酸腺苷(ATP),考察ATP对菌体生长、1,3 丙二醇(1,3 PD)、其他副产物合成的影响。实验结果表明:添加ATP抑制菌体生长,加入质量浓度为0 4g/LATP,OD值比参照低53%;添加ATP促进单位细胞合成1,3 丙二醇,加入质量浓度为0 4g/LATP,1,3 丙二醇质量浓度/OD值比参照高90%;添加ATP能提高甘油到1,3 丙二醇转化率,加入0 8g/LATP,甘油到1,3 PD的最大转化率达到0 76mol/mol。     

维生素C和E对Klebsiella pneumoniae合成1,3-丙二醇的调控

通过外源添加还原剂的方式调控细胞内NADH/NAD再生系统的状态,研究了40~150 mg/L VC及20~100 mg/L VE对Klebsiella penumoniae合成1,3-丙二醇的影响,发现外源添加150 mg/L VC或30 mg/L VE均可使1,3-PD合成浓度提高20%~30%;但同时也提高了某些副产物的合成浓度,对代谢流分布的调控作用不明显;1,3-丙二醇得率稍有提高但不显著. 提高1,3-PD得率宜从代谢节点(丙酮酸)通量调节方面考虑.     

醛脱氢酶基因敲除对克氏肺炎杆菌合成1，3-丙二醇的影响

利用Klebsiella pneumoniae厌氧发酵甘油生产1,3-丙二醇时，一部分甘油通过氧化代谢途径大量合成副产物乙醇，降低了1,3-丙二醇的得率.醛脱氢酶ALDH是乙醇合成途径的关键酶之一，其催化作用不仅消耗了大量甘油，还将还原型辅酶NADH氧化为NAD⁺，降低了同为NADH依赖型的1,3-PD合成途径的效率.本文以醛脱氢酶ALDH为改造目标，以K.pneumoniae为宿主，通过同源重组技术在K.pneumoniae M5aL的ALDH基因中成功地插入了四环素抗性基因，经抗性筛选和基因水平鉴定，得到两株ALDH基因敲除的重组菌0623-1hb及0623-1hc.本文研究了这两株重组菌的生长代谢特性，结果表明两株重组菌的ALDH酶活基本检测不到，菌体生长受到明显抑制，乙醇合成浓度比出发菌株K.pneumoniae M5aL降低了43%～53%，1,3-PD合成浓度及摩尔得率分别提高了27%～42%和19%～24%.     

分段通气对Klebsiella pneumoniae生产1,3-丙二醇关键酶和辅酶的影响

通过考察1,3-丙二醇合成中关键酶、辅酶的变化,研究了分段通入空气对Klebsiella pneumoniae厌氧发酵生产1,3-丙二醇的影响. 与对照组相比,在发酵前期(12 h)通入空气4 h后,甘油脱氢酶酶活提高1.5倍,1,3-丙二醇氧化还原酶酶活提高18%,1,3-丙二醇浓度提高16%;发酵后期(28和48 h)通入空气后,甘油脱氢酶酶活不变,1,3-丙二醇氧化还原酶酶活下降,1,3-丙二醇浓度降低. 发酵前期,通气对辅酶NADH和NAD的浓度无影响;发酵后期,菌体生长停滞,辅酶的浓度也随之下降.     

1,3-丙二醇分批发酵动力学模型

在分批发酵中，研究了Klebsiella pneumoniae的生长、底物甘油消耗及1,3-丙二醇的产生特性. 基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程，得到了描述1,3-丙二醇分批发酵过程的动力学模型及模型参数，该组模型能很好地拟合发酵过程，并在初始甘油浓度变化较大的范围内表现出很好的适用性. 同时，所建立的模型也基本反映了Klebsiella pneumoniae分批发酵过程的动力学特征. 基于分批发酵动力学模型，提出了以甘油为单一碳源时的底物流加策略，通过与其他流加策略条件下的发酵对比实验表明，通过基于动力学模型的流加策略可获得更高的1,3-丙二醇浓度及生产强度.