br基因的克隆及表达

细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,BR)是嗜盐菌细胞膜上唯一的一种光能转换色素蛋白,BR以视黄醛(retinal)作辅基,在光诱导下吸收光子后会产生一系列的光循环中间体,最后又回到原始状态．由于BR这种独特的分子结构和光循环过程,及其作为一种具有光敏特性的蛋白质生物分子,可嗵过生物学技术进行改造,正引起光子学研究及生物学研究领域的高度注意．从Genbank查询br基因的全序列,然后采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术,采用DNA star软件辅助设计了上下游引物,以嗜盐菌(Halobactrium Halobium)的基因组DNA为模板克隆获得了完整的细菌视紫红质基因br,并且将经测序鉴定的br基因重组到原核高效表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌E．coli．,将阳性转化子经IPTG诱导表达获得BR与GST(谷胱苷肽转移酶)的融合蛋白后,提取蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western印迹反应,检测表达结果为阳性,且表达蛋白的大小与预想的一致．     

CTB-InsB融合基因在大肠杆菌中的表达研究

构建了一种霍乱毒素B亚基（CTB）与人胰岛素B链（InsB）的融合基因，并克隆入表达载体pGEX-4T-1中，命名为pGEX—CTB-InsB。该融合蛋白在大肠杆菌中的表达产物以包涵体形式存在，分子量约为43kDa。包涵体经溶解和复性后，使用GSTrapFF亲和层析柱纯化得到融合蛋白。经SDS-PAGE和Western免疫印迹分析证实纯化蛋白为重组目的蛋白。     

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性

将大豆Em（LEA1）基因构建到原核表达载体pET28-Em中．转化大肠杆菌，经SDS—PAGE电泳及电喷雾质谱鉴定．结果显示，经IPTG诱导的重组菌可表达约18kDa的特异蛋白．这种蛋白具有良好的可溶性和热稳定性．在含800m mol／L NaCl培养基中，含空载体的对照菌生长迟滞期约为50h，含Em基因的重组菌生长迟滞期为32h，表明大豆Em蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性．在此基础上，构建了含Em基因的真核表达载体pBI—Em．再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草．PCR及RT-PCR结果显示，大豆Em基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中，并能正常转录．转化率为53％．转Em基因烟草植株在含有质量分数1．5％NaCl的培养基中生长状况好于对照植株，叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片．结果表明，大豆Em基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性．     

人APOBEC3G基因克隆、表达、纯化及多克隆抗体制备

为了获得人APOBEC3G蛋白及其多克隆抗体,从H9细胞中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得人APOBEC3G基因.将测序鉴定过的APOBEC3G基因克隆到原核表达载体pET-32a上,以包涵体的形式在E.coli BL21(DE3)中高效表达,由于APOBEC3G蛋白C端融合了6×His标签,有助于对蛋白的纯化及鉴定.应用酶切技术、SDS-PAGE及Western Blot等方法确保基因片段的正确性和蛋白的特异性.纯化后的APOBEC3G蛋白用来免疫日本大耳白兔,用间接ELISA法测定兔多克隆抗体滴度,获得了纯度超过80%的APOBEC3G融合蛋白,抗APOBEC3G多克隆抗体滴度高达1:102 400.     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

糖结合单元-绿色荧光蛋白探针的制备及应用

利用RF克隆方法将全基因合成的来自约氏梭菌Clostridium josui家族28糖结合单元CjCBM28的编码基因与绿色荧光蛋白编码基因融合,构建了探针CjCBM28-GFP的大肠杆菌表达载体,表达载体被热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并进行了诱导表达。利用亲和层析法纯化出的CjCBM28-GFP与预处理及未预处理的玉米秸秆在30℃温育3h,荧光显微镜观察结果表明,CjCBM28-GFP探针对预处理木质纤维素的结合能力强于未经预处理的样品。研究结果可用于测定预处理木质纤维素所暴露的结晶和非结晶纤维素含量,分析不同方式预处理的木质纤维素的水解程度。     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

生孢噬纤维菌CMcase基因的分离与表达

从生孢噬纤维菌中分离完整的基因组DNA,经过PstI限制性内切酶部分酶切后,在T4DNA连接酶作用下,将酶切的片段连接到载体pUC18的PstI位点中,然后转化到E.coli DH5α中,构建了基因组文库,经过筛选获得4.2x103个重组子。经过刚果红平板筛选获得了含有CMCase基因片段的重组子,在E.coli中进行表达,E.coli在37℃培养25~30h,培养液中CMCase活力达到22.8U/mL。     

HBV/HEV融合抗原大肠杆菌表达包涵体的变复性和纯化

利用乙型肝炎病毒adr型的S抗原基因和戊型肝炎病毒China-D型的ORF2编码区的羧基末端中的部分序列构建融合抗原表达载体,在大肠杆菌中表达时,出现了大量包涵体,我们对包涵体进行洗涤,变性,复性,金属亲和层析柱和凝胶过滤纯化后,蛋白的相对含量达98%.采用Western blot对目的蛋白活性进行检测,具有乙肝和戊型肝抗原活性.为提高资源利用效率,降低成本,提高产量,以及进一步研发疫菌用抗原提供了实验基础.     

HBV/HEV二价抗原的载体构建与表达

为构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价疫苗抗原的大肠杆菌高效重组原核表达载体,采用PCR方法扩增出HBV的S基因,及HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414-606aa的基因片段,经过T载体连接、菌落PCR、双酶切、测序鉴定后,将这两部分重组入含有增强子的pT-T7高效的E.coli表达载体中。构建了pT-T7SE表达载体并且表达出相应的目的蛋白。该实验结果为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中的表达与纯化

从嗜热菌Thermus aquaticus中分离出的Taq DNA聚合酶由于其热稳定性，在聚合酶链式反应(PCR)中得到广泛的应用，我们根据编码Taq DNA聚合酶的基因序列，设计出一对引物，通过PCR扩增出Taq DNA聚合酶基因，并将其克隆到表达载体pET-15b中，转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，重组Taq DNA聚合酶在大肠杆菌中实现了大量表达。经过热变性、亲和层析、阳离子交换层析获得了电泳纯的重组Taq DNA聚合酶。本研究的生产程序可作为Taq DNA聚合酶生产的一种新方法。     

松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46,克隆基因与已报道的纤维素酶基因BXC10（GenBank登录号：FJ598020.1）的同源性高达99%,将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-BXC。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2＋-NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶,DNS法进行的活性测定表明,部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性,其最适温度为45℃,最适pH为4.0。     

sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白（PPA）的亚基B（PPAb）的融合蛋白,将PPA6基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后荻得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。N时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad—EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

融合蛋白sCAR-TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1(TSP-1)氨基酸序列(RFYVVMWK),以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR-TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

纤维素酶E_5基因在E.coli中的克隆与表达

将含纤维素酶 E5基因的质粒 p D5 4 1用 Nco I和 Eco R I双酶切后 ,经电泳分离获取含 E5基因的小片段 ,将该片段定向插入表达质粒 p SE4 2 0的多克隆位点上 ,进一步将重组 DNA转入大肠杆菌宿主 .采用刚果红染色法检测出选择性平板上的转化子具有羧甲基纤维素酶 (CMCase)活性 .摇瓶产酶试验进一步表明 ,基因重组后的大肠杆菌能高效表达 E5基因并将产物分泌出胞外 ,培养液中可检测到的CMCase活力达 31.6 U/ m L .该研究结果为进一步构建高效纤维素分解菌株打下了良好的基础 ,具有重要的学术意义和实际应用价值 .     

融合蛋白sCAR—TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1（TSP-1）氨基酸序列（RFYVVMWK）,以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR—TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

大肠杆菌中可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21及制备

为在大肠杆菌中高效、非融合、可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF-21),研究了纯化方法,以获得具有较高生物活性的rhFGF-21。全基因合成人成纤维细胞生长因子21cDNA序列,克隆进原核表达载体pET-3c,在转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中进行表达。表达产物经盐析、层析等方法纯化后,利用3T3-L1细胞鉴定其促葡萄糖摄取的生物学活性。结果表明:rhFGF-21在BL21(DE3)PlysS实现了高效、非融合、可溶性表达,目的蛋白占菌体总蛋白的20%左右;表达产物经纯化后,纯度可达95%以上;表达产物能够明显促进3T3-L1细胞对葡萄糖的吸收。该方法成功实现了rhFGF-21在大肠杆菌中高效可溶性表达。