一株产凝乳酶解淀粉芽孢杆菌的筛选、鉴定及酶学性质

采用酪蛋白培养基,从甘南牦牛放牧区分离筛选产凝乳酶细菌。通过形态学、生理生化特征和16SrDNA序列同源分析对菌株进行鉴定,并对该菌株所产凝乳酶的特性进行了研究。从牧区采集的56个样品中共筛选得到6株产凝乳酶细菌,复筛得到一株凝乳活力高、蛋白水解力低的菌株GN4.1,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),在麸皮培养基中发酵48h,凝乳活力可达1011.56SU/mL,蛋白水解力为14.61U/mL。凝乳酶的最适作用温度为60℃,65℃加热10min后凝乳活力丧失;最适作用pH为5.5,在pH3.5～8.5内稳定性较好。预期该菌株所产凝乳酶有用于乳品加工业的潜力。     

固定化地衣芽孢杆菌产弹性蛋白酶的研究

为提高弹性蛋白酶的发酵产能,构建地衣芽孢杆菌连续发酵产弹性蛋白酶的生产工艺,本研究采用单因素试验及响应面分析法对地衣芽孢杆菌凝胶包埋固定化的工艺进行探讨,并对固定化细胞的发酵产酶性能进行分析。结果表明,地衣芽孢杆菌的适宜固定化体系是聚乙烯醇（polyving akohol,PVA）、海藻酸钠（sodium alginate,SA）和CaCl2,质量分数分别为8.22%、2.27%和2.42%,固定化交联剂硼酸的质量分数为4%;固定化地衣芽孢杆菌发酵产弹性蛋白酶的活力可达到386 U/mL,是相同接种量的游离细胞发酵酶活力的87%;固定化的地衣芽孢杆菌凝胶球具有很好的稳定性,在摇瓶发酵的条件下可连续使用10 批次以上。以上结果表明,复合凝胶包埋制备的固定化地衣芽孢杆菌细胞可用于连续发酵产弹性蛋白酶的生产工艺。     

枯草芽孢杆菌凝乳酶发酵生产条件及其酶学性质的研究

为了提高枯草芽孢杆菌发酵所产凝乳酶的活力,利用响应面实验法对该菌株的培养条件进行了优化,确定其最佳发酵产酶条件为发酵时间26.76 h、发酵温度31.98℃、p H6.82、装液量40%(v/v)、接种量4%(v/v),在该条件下枯草芽孢杆菌发酵生产的凝乳酶活性为456.72 SU/m L,接近理论预测值461.54 SU/m L。利用乙醇沉淀法对最佳发酵条件下生产的凝乳酶进行提取,加入体积分数为70%的乙醇中沉淀的凝乳酶活性最高。进一步对提取的凝乳酶进行酶学性质研究,结果表明:该酶的最适温度为60℃,且有较强的低温热稳定性,在(40~55)℃范围内保持1 h酶活无显著损失,在60℃保持60 min后完全失活,最适p H为6.5,Ca~(2+)能显著提高其凝乳活性,最大值为1.01×10~6 SU/g,Na~+和K~+的存在完全抑制其凝乳。     

解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶的生产及其酶学性质研究

采用正交试验设计优化了解淀粉芽孢杆菌GSBa-1发酵产凝乳酶的工艺条件:发酵温度35℃,装液量40%,摇床转速180 r/min,发酵时间84 h。在此优化条件下,获得的凝乳酶凝乳活力为558.14 Su/m L。进一步研究了该酶的酶学性质,凝乳酶最适反应温度为55℃,酶活力在25~45℃比较稳定,60℃保持50 min完全失活。在p H5.5时凝乳酶活力最高,在pH 5.5~7.0范围内,随着pH增大,凝乳酶活力逐渐下降,p H 6.5时,凝乳酶活力稳定性最高。Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)以及Al~(3+)均对凝乳酶的凝乳活力有促进作用,其中Ca~(2+)对凝乳活力的促进作用最为显著,且Ca~(2+)浓度为0.020 mol/L时凝乳酶的凝乳活力达到最大值,而Na~+、K~+和Cu~(2+)对凝乳活力均有抑制作用;凝乳酶Km为2.35 g/L,Vmax=1.18 U/m L。     

一株α-高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌产酶培养基的优化

从西藏当雄温泉附近的土壤中筛选到的一株分泌高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌B.licheninformis LT.该菌的原始的淀粉酶活为60 U.经优化培养基(黄豆粉1.5,玉米粉1.5, NaCl 1,K2HPO4 0.01, KH2PO4 0.01, CaCl2 0.4,司盘40 0.1,pH 10.0)在50 ℃、装液量10%、180 r/min的摇床培养72h后, 测得酶活105 U.     

一株产海藻糖合成酶嗜中温芽孢杆菌的鉴定及其酶学性质

由长白山温泉附近土壤中筛选得到产海藻糖舍酶菌株，为革兰氏阳性菌，具有芽孢和鞭毛，其最适生长温度为55℃，对这一菌株进行生理生化指标测定。进一步对该菌株所产海藻糖合酶的酶学性质进行研究，酶反应最适作用pH值为7．0，在pH6．6～7．4时该酶稳定，最适作用温度为35℃，在25-45℃时该酶可稳定保存。     

一株地衣芽孢杆菌噬菌体的分离及其性质分析

从生产碱性蛋白酶的车间附近的下水道淤泥和后处理车间空气中分离得到了一株噬菌体。电镜观察表明该噬菌体有多面体的头部和细长的尾部组成,有着长尾病毒科噬菌体的形态特征。在供试菌种中,该噬菌体以地衣芽孢杆菌为宿主,对其生理特性研究发现,该噬菌体在pH 5-10之间有着很好的稳定性,在高温下有一定的稳定性,且金属离子可以促进其对宿主菌的侵染。根据实验结果绘制出噬菌体的一步生长曲线,可知感染宿主菌的潜伏期约为40 min,爆发期约为110 min。对噬菌体核酸性质的分析发现,其遗传物质为双链线状DNA,其分子量大约为36 kb。     

嗜热地衣芽孢杆菌植酸酶的原核表达及酶学性质研究

将地衣芽孢杆菌SR01（Bacillus licheniformis SR01）的植酸酶phy基因重组于表达载体p GEX-4T-3中,导入大肠杆菌BL21（Escherichia coli BL21）构建工程菌p GX1143,并得到了高效表达。对其酶学性质的研究表明:该酶最适反应p H为5.0,最适反应温度为55℃,具有广泛的p H稳定性和较好的热稳定性;Co²⁺)、Li⁺、Mg²⁺)和Ba²⁺对酶活性有促进作用,Cu²⁺、Pb²⁺、Fe²⁺、Ag⁺、SDS对酶活性有不同程度的抑制作用,并且Pb²⁺、Fe²⁺和SDS对酶活性的抑制作用较强烈;此外,该酶还具有非常好的抗胰蛋白酶水解能力和部分抗胃蛋白酶水解的能力。      

一株产蛋白酶不动杆菌的分离与酶学性质

以脱脂奶粉或羊毛粉为唯一碳氮源,从环境样品中筛选蛋白酶产生菌,首次获得一株高产蛋白酶的醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)E9,初步发酵优化显示,该菌株的最适发酵产酶温度35℃,培养基初始p H 6.0,接种量为质量分数4%,培养时间30 h;发酵培养基:蔗糖10 g/L,牛肉膏15 g/L,K_2HPO_4·3H_2O 7 g/L,KH_2PO_4 3 g/L,MgCl_2·6H_2O 1 g/L。酶学性质初步研究表明,不动杆菌E9所产的蛋白酶属于中性蛋白酶,最适作用温度50℃,最适pH 8.0,在p H5.0~8.0及40℃以下时具有良好的稳定性,酶反应动力学参数Km为7.067 mg/m L,Vmax为966.7μg/(m L·min)。     

一株纳豆芽孢杆菌的产酶条件优化

从一株实验室保藏的产纳豆激酶细菌出发,先对其液体发酵产酶的培养基和培养条件进行优化,在此优化基础上,利用Plackett-Burman试验筛选出影响纳豆芽孢杆菌产酶的3个主要因素:胰蛋白胨添加量、MgSO4添加量、发酵温度,利用Box-Behnken进行响应面试验设计,优化得到最优发酵条件。发酵培养基条件(g/L):胰蛋白胨26.6、乳糖10.0、Na2HPO45.0、NaH2PO41.0、CaCl20.2、MgSO41.35;发酵条件:种龄12h、接种量2%、发酵温度33℃、发酵时间56h、装液量50mL/250mL。此发酵条件下发酵液的纳豆激酶酶活力为743.65U/mL,比优化前提高了232.33U/mL。     

嗜热地衣芽孢杆菌植酸酶的原核表达及酶学性质研究

将地衣芽孢杆菌SR01(Bacillus licheniformis SR01)的植酸酶phy基因重组于表达载体p GEX-4T-3中,导入大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)构建工程菌p GX1143,并得到了高效表达。对其酶学性质的研究表明:该酶最适反应p H为5.0,最适反应温度为55℃,具有广泛的p H稳定性和较好的热稳定性;Co~(2+))、Li~+、Mg~(2+))和Ba~(2+)对酶活性有促进作用,Cu~(2+)、Pb~(2+)、Fe~(2+)、Ag~+、SDS对酶活性有不同程度的抑制作用,并且Pb~(2+)、Fe~(2+)和SDS对酶活性的抑制作用较强烈;此外,该酶还具有非常好的抗胰蛋白酶水解能力和部分抗胃蛋白酶水解的能力。     

一株凝结芽孢杆菌产芽孢条件的研究

通过培养基组成正交试验及培养条件单因素试验,对一株凝结芽孢杆菌的产芽孢条件进行了优化,优化后的培养基组成(质量分数)为酵母粉3g/L,蛋白胨5g/L,牛肉膏2g/L,MnSO4 0.005g/L,NaCl2g/L,K2HPO4 3g/L,MgSO40.02g/L.最优的培养条件为温度40℃,初始pH值为7.0,转速210r/min,装液量为250mL的三角瓶装30mL,接种量为6%(v/v),发酵时间为48h.最终的芽孢数为9.1×100 cfu/mL.     

中高温大曲中一株耐热地衣芽孢杆菌耐受性及产酶特性的初步研究

以中高温大曲中分离得到的一株耐热地衣芽孢杆菌为出发菌株,通过对地衣芽孢杆菌进行耐受性分析,发现其耐盐、耐p H能力较强;能耐14%的盐浓度,能耐p H范围为p H3.0~10.5;耐乙醇能力较弱,不能耐6%的乙醇浓度;耐温度能力较好,最高能耐55℃的高温。通过3种酶鉴定培养基对地衣芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力进行定性鉴定,发现在3种酶鉴定培养基上均能形成透明圈。通过对地衣芽孢杆菌的产酶特性研究发现,在液态培养条件下,地衣芽孢杆菌产淀粉酶和蛋白酶的最适时间均为36 h,最适产酶温度分别为45、40℃,最适产酶转速均为240 r/min;地衣芽孢杆菌产FPA酶和CMC酶的最适产酶时间分别为36、48 h,最适产酶温度均为30℃,最适产酶转速分别为120、90 r/min。     

产过氧化氢酶淀粉液化芽孢杆菌的筛选鉴定及酶学性质研究

为了得到过氧化氢酶高产菌株,从江苏省土质属碱性地区的土壤中分离的102株菌株进行筛选,获得1株高过氧化氢酶活性的菌株,命名RU-22,酶活值达到189.2 U/mL。16S rDNA序列测定,为淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。通过对RU-22酶学性质的研究,确定该菌株的最适温度为40℃,热稳定性在40～50℃较好;最适pH为7,pH在6.0～8.0时酶的稳定性较好;Cu~(2+)、Mg~(2+)和Fe~(2+)对酶活没有影响,Zn~(2+)和Mn~(2+)则对酶活有一定的抑制作用;经紫外照射2 h后酶活有明显的提高,为下一步淀粉液化芽孢杆菌、过氧化氢酶的实际应用奠定了一定的基础。     

产普鲁兰酶蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及酶学性质研究

利用选择性培养基从广西南宁淀粉加工厂附近土壤中分离出一株具有产普鲁兰酶能力的野生菌株GXBC-2。该菌株革兰染色为阳性,形成芽孢,菌体细胞杆状,结合生理生化特征和16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌株为Bacillus cereus GXBC-2。对该菌所产普鲁兰酶的性质研究表明:酶的最适反应温度为50℃,在30～50℃范围内稳定,最适pH为7.0,稳定pH范围为6～8.5。产物经HPLC分析证明,该酶能水解普鲁兰糖产生麦芽三糖,对可溶性淀粉不起作用,所以该酶属于I型普鲁兰酶。     

一株产纤溶酶芽孢杆菌的分离鉴定与产酶特性

从大曲中分离到一株产纤溶酶的芽孢杆菌,命名为B4。该菌革兰氏染色呈阳性,菌体杆状,专性好氧,能够利用甲醇作唯一碳源。通过形态特征观察、生理生化特性并结合基于16S rDNA序列比对及系统发育分析,鉴定菌株B4为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。该菌最适生长温度为35 ℃,最适发酵初始pH值为7.0,发酵42 h酶活力最高可达649 U/mL。     

一株不动杆菌产普鲁兰酶的分离纯化及酶学性质的研究

微生物所产的普鲁兰酶用途广泛,但国内对普鲁兰酶的研究水平不够深入,使其工业化应用受到了极大的限制。通过硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-75层析和DEAE SepHarose Fast Flow强阴离子柱层析技术,对提取的普鲁兰酶进行初步的分离纯化,得到普鲁兰酶纯酶。对该酶的酶学性质进行研究,结果表明,普鲁兰酶最适的硫酸铵分级沉淀浓度为60%,该普鲁兰酶的最适温度为50℃;酶的最适作用pH为8.0;在55℃至60℃之间酶活力稳定最好;在pH7.0-9.0范围内保持较稳定的活性;Ca~(2+)对酶激活作用最强,Ba~(2+)对酶的抑制作用较强;普鲁兰糖作底物时该酶活性最强。     

中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质

采用稀释平板分离法从土壤中分离到一株产中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4．通过单因素碳、氮源以及正交试验确定了最佳产酶培养基配方，同时还研究了起始pH值、金属离子、接种量对产酶的影响以及温度、pH值、金属离子以及表面活性剂对酶稳定性的影响；以最佳培养基为发酵培养基，于37℃、160r／min振荡培养48h，酶活达2519．35U／mL；该酶最适作用温度为55℃，最适作用PH值为7．5，在pH7．5缓冲体系中，55℃反应60min后仍有50％的酶活力，Ca^2＋和表面活性剂对酶有一定的激活作用，但激活作用不明显。     

嗜热地衣芽孢杆菌SR01葡聚糖酶基因的原核表达及酶学性质研究

从一株嗜热地衣芽孢杆菌SR01中克隆了β-葡聚糖酶的编码基因,并通过原核表达对重组酶的酶学性质进行了研究。结果显示,该酶编码基因ORF包含741bp,编码246个氨基酸,理论分子量为28.03ku,等电点为6.42。在温度30℃、浓度0.05mmol/L条件下IPTG诱导4h,重组蛋白得到显著表达。酶的最适反应温度、pH值分别为55℃、pH6.0~7.0;在温度40~90℃、pH5.0~10.0条件下具有良好的稳定性。Cu2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+、EDTA对该酶有不同程度的抑制作用,K+、Na+对该酶起轻微的激活作用。该酶对体外模拟胃肠环境具有较好的耐受性,在模拟胃液中放置90min仍有80%左右的活性,胰液对该酶有一定的激活作用。     

一株产纤维素酶枯草芽孢杆菌的麸曲制作及其产酶特性研究

目的：为开发利用产纤维素酶菌种的资源利用率。方法：采用产纤维素酶系齐全、活性高的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）XWS-A制作细菌麸曲,通过Box-Behnken响应面设计优化制曲工艺,并对其产酶特性进行探讨。结果：制曲最佳工艺为控制接种量7.5%,培养温度46 ℃,含水量46%,该工艺条件下生物量达到了（4.5±0.3）×10¹¹ CFU/g;成品麸曲具有3种纤维素酶活性,最佳测定条件下内切β-葡聚糖酶活力为（2 510±70） U/g,外切β-葡聚糖酶的活力为（15±2） U/g,β-葡萄糖苷酶的活力为（30±3） U/g。结论：制作麸曲有利于产纤维素枯草芽孢杆菌XWS-A获得有效增殖、提高产酶量及维持酶活性。