普通烟草茄尼基焦磷酸合酶基因NtSPS的克隆和表达分析

为揭示烟草茄尼基焦磷酸合酶（Nicotiana tabacum solanesyl diphosphate synthase, NtSPS）在烟草茄尼醇生物合成中的作用,分离了烟草品种红花大金元茄尼醇生物合成关键基因NtSPS1和NtSPS2,并对其进行了序列比对、进化分析和亚细胞定位分析,研究了其在烟草植株不同器官的表达水平以及烟草植株不同器官的茄尼醇、叶绿素含量与NtSPS表达水平的相关性。结果表明,NtSPS1和NtSPS2开放读码框（ORF）大小分别为1209、1206 bp,分别编码402、401个氨基酸;NtSPS1和NtSPS2均存在2个保守的DDxxD结构域,这与NtSPS功能发挥相关;NtSPS1、NtSPS2与番茄SPS同源性较高,这与烟草、番茄均为茄科作物有关;NtSPS1、NtSPS2均定位于叶绿体中;烟草植株不同器官NtSPS1和NtSPS2表达水平排序为：叶 > 茎 > 根,这与茄尼醇、叶绿素在烟草植株中的分布规律一致。本研究可为NtSPS调控烟草茄尼醇生物合成机制的深入研究奠定基础。     

我国烤烟茄尼醇含量及其与烟草和烟气主要化学成分的相关性

为明确我国烤烟茄尼醇含量状况及其与烟叶品质的关系,选取2010—2011年代表产区烟叶266份,分析了总茄尼醇、游离茄尼醇、游离茄尼醇/总茄尼醇的比值数据特征以及产区、部位、品种间的差异,研究了茄尼醇与烟草和烟气主要化学成分的相关性。结果表明,我国烤烟总茄尼醇、游离茄尼醇含量分别为0.21%～3.48%、0.10%～2.19%;北方烟区烤烟总茄尼醇含量显著低于其他烟区,但游离茄尼醇比例较高;上部叶茄尼醇含量显著大于中、下部叶;红花大金元相对云烟97、云烟87、K326具有较低的总茄尼醇含量;烤烟茄尼醇含量与烟叶质量评价指标（石油醚提取物、环己烷提取物、总生物碱、丙二酸、还原糖等）及烟气安全性指标（焦油、一氧化碳、苯并芘、苯酚、氨气、氰化氢、NNK）呈极显著相关,茄尼醇含量高的烟叶,其主流烟气有害成分释放量显著较高。     

烟草NtDXS2基因的克隆及表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, DXS)是萜类化合物合成过程中的限速酶。为明确DXS2基因在烟草萜类化合物合成中的作用,利用RACE技术从普通烟草中克隆了NtDXS2基因,分析NtDXS2的序列特征以及NtDXS2在不同组织、水杨酸处理中的表达。结果表明,NtDXS2 cDNA全长2 407 bp,编码713个氨基酸。NtDXS2与番茄DXS2氨基酸序列的一致性最高,为91.1%;与NtDXS1氨基酸序列的一致性为69.2%。亚细胞定位及蛋白结构域预测结果显示,NtDXS2定位于叶绿体,含有DXS的保守功能域。进化分析表明,NtDXS2属于DXS2亚家族,与番茄DXS2亲缘关系最近。qPCR结果表明,NtDXS2在叶中表达量较高,在根和雄蕊中表达量较低,在雌蕊和萼片中几乎不表达。在水杨酸处理下,NtDXS2的表达量升高,推测NtDXS2可能参与烟草叶片腺毛中萜类次生代谢物的合成以及烟草的抗病反应。     

基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析

为研究烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因的表达模式和功能,从普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元中克隆了NtDXR基因,并通过荧光定量PCR技术分析了NtDXR在红花大金元不同发育时期、不同组织中的表达模式。同时利用CRISPR/Cas9技术构建了NtDXR敲除载体,获得了DXR基因突变的植株。结果表明:NtDXR基因在花中的表达量最高,在雌蕊和叶中次之;利用CRISPR/Cas9系统定点敲除NtDXR基因后,检测目的基因靶位点序列发现有碱基的插入、缺失与置换,并且部分T_0代转基因阳性植株呈现白化表型,暗示NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成过程中起重要作用,推测NtDXR基因的突变能阻断烟草质体色素的合成。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶类似基因的克隆及其功能研究

利用同源克隆法从普通烟草(Nicotiana tabacum)红花大金元的cDNA 中克隆到一个新基因NtGGPPSL(Geranylgeranylpyrophosphate synthase-like),其编码区全长为813 bp。Blast 结果显示该基因与林烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)和番茄(Solanum lycopersicum)的GGPPS 小亚基基因的相似度分别达到了99%、91% 和82%,但其编码的蛋白质序列缺失了GGPPS小亚基的关键功能域“DDXXXXD”,这表明NtGGPPSL 基因的功能可能与GGPPS 小亚基基因不同。为了深入研究NtGGPPSL 基因的功能,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析NtGGPPSL 基因在普通烟草不同时期和器官中的表达差异。利用TRV 病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中NtGGPPSL基因的表达,在成功沉默该基因之后,检测烟草中质体色素(新黄质、紫黄质、叶黄素、叶绿素a/b、β-胡萝卜素)含量的变化。结果显示,NtGGPPSL 基因在茎和根中的表达量明显高于其他器官。与对照组相比,在NtGGPPSL 基因沉默后,烟草叶片发生明显的褪绿现象,质体色素含量显著降低,表明该基因参与了叶绿素的合成,这为VIGS 体系提供了一个可参考的指示基因,也为烟草的遗传改良和基因功能研究提供了理论依据。      

烤烟品种耐寒性及相关生理指标的研究

采用8℃和5℃低温胁迫处理,对烤烟品种NC82、K326、RG11、V2、红花大金元的生长量、耐寒性、叶绿素含量、根系活力、电解质渗漏率和丙二醛含量进行了研究。结果表明,红花大金元的抗寒性较强,NC82、RG11次之,K326、V2较差。对各项指标间相关性分析表明,冷害指数与丙二醛含量、根系活力、叶绿素含量之间呈极显著相关,与细胞膜透性之间呈显著相关;细胞膜透性与丙二醛含量之间呈极显著相关。根系活力、叶绿素含量、丙二醛含量和电解质渗漏率是烤烟抗寒性鉴定的有效指标。     

高油酸甘蓝型油菜油酸积累动态

为了解高油酸甘蓝型油菜突变种质的特点,分析了两组材料营养器官和生殖器官中油酸积累的动态变化。结果表明：营养器官油酸相对含量从高到低排序为根、茎、叶。不同生育期营养器官油酸含量变化表现为：根中,成熟期高,其次是苗期,然后是越冬期、蕾薹期、返青期,花期最低;茎中,成熟期最高,其次是返青期,花期较少,苗期、越冬期和蕾薹期最少;叶中,蕾薹期最高,花期次之,苗期、越冬期和返青期最少。油菜开花2周内,角果中油酸积累以果皮为主,第3周起则转为以种子为主。果皮中油酸相对含量在开花后3周达到最大值。油菜营养器官中的油酸与成熟种子中的油酸相对含量均呈显著正相关（r=0.81＊）。除花期外,各生育期营养器官与生殖器官中的油酸相对含量呈极显著正相关（r=0.92＊＊）。表型结果说明供试品系的油酸调控基因是组成型表达,育种上可通过检测营养器官油酸含量来预测和筛选种子高油酸含量的材料。     

基于CRISPR/Cas9技术的烟草CPS2基因敲除及功能分析

为明确柯巴基焦磷酸合酶基因(CPS2)的功能和调控机制,利用CRISPR/Cas9技术对高香气烤烟品系8306中的CPS2基因进行定向编辑,得到了7株靶位点单碱基A/T/C插入的转化植株。利用q-PCR技术分析转化植株二萜类关键基因的表达,并利用GC/MS分析叶面分泌物成分及香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)含量(质量分数)。结果表明:(1)T0代转化植株CPS2及ABS表达量显著降低,冷杉醇和赖百当烯二醇含量也显著降低。(2)DXR表达量均显著升高,GGPP含量也大幅提高。(3)CYC-1和CYP71D16表达量差异较大,西柏三烯二醇出现小幅降低。(4)T0代转化植株的株高、茎围、叶间距、最大叶长、最大叶宽均增加。因此,敲除CPS2能够抑制赖百当类化合物合成,有助于上游途径中萜类合成前体GGPP的积累,可能抑制西柏三烯二醇积累,同时使植株表型性状发生变化。     

一个受青枯病菌诱导的烟草功能基因NtCNGC1的克隆与表达分析

前期转录组研究发现1个环核苷酸门控离子通道（CNGC）基因在抗青枯病烟草品种DB101中上调表达,推测可能参与抵抗烟草青枯病菌侵染的防卫反应。为进一步研究该基因在烟草诱导防御反应中的作用,本研究采用PCR扩增法从DB101中获得烟草CNGC基因的cDNA和基因组序列,命名为NtCNGC1基因。生物信息学和基因表达分析表明,该基因含有8个外显子和7个内含子,编码区（CDS）全长2154 bp,编码717个氨基酸,蛋白分子量为83 kD,理论等电点为9.35。在NtCNGC1基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到防御与应激反应、病原菌应答、水杨酸响应、真菌激发子响应及伤口响应等应答元件。NtCNGC1基因在烟草根中表达最高、茎中其次、叶中最低。受青枯病菌诱导后,NtCNGC1基因在抗病品种（DB101）中的表达量明显高于感病品种（红花大金元）。初步证实NtCNGC1为烟草青枯病抗性相关基因。      

外源水杨酸对低温胁迫下低温敏感性不同的烤烟品种烟叶生理特性的影响

  目的  探究低温胁迫下外源水杨酸对低温敏感型不同烤烟品种叶片生理特性的影响,并筛选最佳外源水杨酸的缓解浓度。  方法  以低温不敏感型品种红花大金元及低温敏感型品种K326为材料,通过盆栽试验研究不同浓度外源水杨酸对4℃低温胁迫下红花大金元和K326叶片相对电导率（REC）、丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶活性、渗透调节物质含量及多酚代谢的影响。  结果  低温胁迫下,2个低温敏感性不同的烤烟品种的相对电导率、丙二醛含量、多酚氧化酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性均显著上升,其中,K326的丙二醛含量上升幅度远大于红花大金元,达94.07%;而3个抗氧化酶活性均被显著降低,K326的可溶性糖含量及总酚含量、红花大金元的可溶性蛋白含量均显著上升。施加外源水杨酸后,K326及红花大金元的叶片相对电导率及丙二醛含量均显著降低,而3个抗氧化酶活性及苯丙氨酸解氨酶活性均显著上升,红花大金元的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量、K326的总酚含量均显著上升;当外源水杨酸浓度为50~100 mg/L时对各个指标的缓解效果较好。  结论  外源水杨酸浓度50 mg/L处理对红花大金元及K326的缓解效果均达到最佳。      

不同品种类型芝麻品质性状的比较分析

为全面分析不同品种类型芝麻的品质性状及其与重要农艺性状间的关系,筛选294个代表性芝麻品种资源,通过多点种植和测定籽粒脂肪、蛋白质、芝麻素和芝麻林素含量,对不同品种类型芝麻的品质性状进行了差异比较,并对品质性状之间和品质性状与农艺性状的相关性进行了分析。结果表明,294个芝麻品种脂肪、蛋白质、芝麻素和芝麻林素平均含量分别为52.77%、20.41%、310 mg/g和1.92 mg/g。不同株型芝麻,单秆型品种脂肪、芝麻素含量极显著高于分枝型品种,蛋白质含量显著低于分枝型品种,芝麻林素含量差异不显著;不同叶腋花数芝麻,单花型品种脂肪、芝麻素含量极显著低于三花型品种,蛋白质含量极显著高于三花型品种,芝麻林素含量显著低于三花型品种。不同品种芝麻脂肪含量与蛋白质含量呈极显著负相关,与芝麻素、芝麻林素含量呈极显著正相关;蛋白质含量与芝麻素、芝麻林素含量呈极显著负相关;芝麻素与芝麻林素含量呈极显著正相关;脂肪含量与生育期、籽粒颜色L*值、b*值呈极显著正相关,与千粒重、籽粒长度、宽度、长宽比和籽粒颜色a*值呈极显著负相关;蛋白质含量与千粒重、籽粒长度、籽粒宽度、籽粒长宽比呈极显著正相关,与生育期、籽粒颜色L*值及b*值呈极显著负相关,与籽粒颜色a*值相关性不显著;芝麻素含量与生育期呈显著正相关,与籽粒长宽比、籽粒颜色L*值及b*值呈极显著正相关,与千粒重、籽粒长度呈极显著负相关,与籽粒宽度、颜色a*值相关性不显著;芝麻林素含量与生育期、籽粒颜色a*值及b*值呈极显著正相关,与千粒重、籽粒长度、籽粒宽度呈极显著负相关,与籽粒长宽比、籽粒颜色L*值相关性不显著。     

不同烤烟品种主要挥发性香气物质含量的比较与分析

采用同时蒸馏萃取-气相色谱/质谱法对云南主要烟区4个主栽品种红花大金元、K326、云烟87和云烟85共计390个样品的主要挥发性香气物质进行了分析。结果表明,红花大金元和K326品种上部和中部烟叶中主要挥发性香气物质总量、新植二烯和呋喃类化合物含量均显著高于云烟87和云烟85;红花大金元上部和中部烟叶的醇类和酚类化合物含量均显著高于K326、云烟87和云烟85,氮杂环类化合物含量则显著低于后3个品种。     

不同烤烟品种对青枯病胁迫的生理响应及抗性分析

为明确不同抗性烤烟品种（系）对青枯病侵染的响应机制,以抗病品种（系）岩烟97、G80、633K和易感品种翠碧一号、红花大金元为材料,通过盆栽试验研究了青枯菌侵染胁迫下不同抗性烤烟品种（系）发病情况、生物量、激素、丙二醛（MDA）含量及抗氧化酶系活性的变化。结果表明,易感品种的发病率和病情指数高于抗病品种,红花大金元和翠碧一号的发病率和病情指数分别达到80%、68.89和70%、41.11;与未接种青枯菌烟株（CK）相比,接菌后所有品种（系）的生物量和丙二醛（MDA）含量均显著下降,抗病品种（系）生物量降幅均显著小于易感品种,633K生物量降幅最小为37.47%,红花大金元降幅最大为84.01%。抗病品种（系）MDA含量降幅均显著大于易感品种,633K降幅最大为45.67%,红花大金元降幅最小为13.02%;各品种受青枯菌胁迫后超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性均显著提高,抗病品种（系）的增幅大于易感品种;抗病品种（系）的茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）含量均显著增加,易感品种SA含量显著增加,而JA含量显著降低。在青枯菌侵染胁迫下,抗病品种能够更有效...     

氮素营养对烤烟叶片淀粉积累及SPS、淀粉酶活性的影响

在大田条件下研究了烤烟红花大金元(HD)和K 326叶片淀粉积累动态,分析比较了不同施氮量和氮素形态对叶片淀粉含量和蔗糖磷酸酯合成酶(SPS)、淀粉酶活性的影响.烟株生长进入成熟期后,叶片开始快速积累淀粉,接近成熟时达到最高;中部叶片淀粉含量HD为40%左右、K 326为25%左右.成熟期叶片淀粉含量、SPS活性与施氮量呈负相关,HD淀粉酶活性随施氮量增加呈下降趋势,K326淀粉酶活性与施氮量的关系在刚封项后为负相关,叶片接近成熟时为正相关.施氮不足或过量会增加原烟淀粉含量.氮素形态对HD淀粉代谢的影响不如K 326明显;在N-NH4+N-NO3-为11时,K 326淀粉含量、SPS和淀粉酶活性较低.     

不同品种（系）红花芽苗菜产量和品质研究

旨在研究红花种子不同亚油酸含量与其芽苗菜的质量关系,为红花芽苗菜的科学生产提供参考。对8个不同亚油酸含量的品种(系)红花芽苗菜产量和品质进行分析比较。结果显示,种子中PI305192亚油酸含量最高,其芽苗菜下胚轴长度和可食鲜重均最大,鲜重显著(P0.05)高于PI544040及其他品种(系)。川红1号和PI198294亚油酸含量极显著(P0.01)低于PI305192,但又极显著高于PI401479和PI470942,其中川红1号芽苗菜可溶性蛋白含量最高,与PI305192和PI198294相比差异不显著;游离氨基酸和可溶性糖含量,PI198294和川红1号极显著高于其他品种(系);总多酚含量以川红1号、PI198294和PI544040较其他品种(系)高;川红1号总黄酮含量高,PI198294总黄酮含量也不低。说明川红1号和PI198294芽苗菜品质较优。试验还发现,红花种子亚油酸含量与芽苗菜的可食鲜重、可食干重及可溶性蛋白含量极显著正相关,而种子油酸含量则与上述指标呈极显著负相关。总体上,种子亚油酸含量高的品种(系),其芽苗菜产量和部分品质较油酸含量高的品种(系)相对更好。     

水钾耦合对大豆光合特性及其产物积累运转的影响

盆栽条件下,研究了不同生育时期水钾耦合对大豆光合特性及水分利用效率的影响,并对光合速率与各器官干物重进行相关分析。结果表明：苗期与花期控水时,土壤水分及水钾互作极显著影响净光合速率（Pn）;结荚期控水时,水分极显著影响Pn。花期与荚期控水后测定的Pn要高于苗期的Pn。水钾耦合对光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）和气孔导度（Gs）的影响趋势相似,即水分效应要优于钾肥,且一般而言同一钾肥水平下,土壤水分的影响表现为：充足W4〉适宜W3、特涝W5〉略旱W2〉特旱W1。只有当土壤水分供应适宜（W3）时,钾肥的施用提高了植株的Pn、Tr和Gs。水分对植株水分利用效率（WUE）的影响要优于钾肥,且水分为正效应。苗期及开花期控水条件下,植株的Pn与根、茎、叶干物重呈极显著正相关（p〈0.01）,且Pn与各器官的相关程度表现为茎〉叶〉根;结荚期植株Pn与根、茎、叶干物重仍呈极显著正相关（p〈0.01）,与荚粒干物重呈显著正相关（p〈0.05）。     

大理红大品种不同等级烟叶主要化学成分和多酚类物质分析

以大理南涧两年(2008-2009)的红花大金元品种各24个等级48份烟叶样品为材料,测定了不同等级烟叶中主要化学成分和多酚类物质含量,对不同等级、不同叶组烟叶所测物质成分含量的差异,以及主要化学成分与多酚类物质间的相关性进行了比较分析.结果表明,随着烟叶部位的升高,多酚和烟碱含量增加;总糖和还原糖含量中部叶最高,下部叶最低;上部和下部叶中,随着叶色加深,多酚、总糖和还原糖的含量都降低;同一部位和相同颜色的烟叶,等级越高,多酚、总糖和还原糖含量越高;芳香值中部烟叶最高;主要多酚类物质与糖类物质和K₂O呈极显著正相关,与含氮化合物呈显著或极显著负相关.控氮降碱依然是进一步提高大理南涧红大上部烟叶质量可用性的重要措施之一.     

不同基因型烟草对氮素营养响应的差异研究

采用水培盆栽试验,研究了氮素营养对不同基因型烟草幼苗生长的影响.结果表明,不同基因型烟草对氮素营养的响应有明显差异,其硝酸盐还原酶活性、叶绿素含量、根系总吸收面积、氮含量均与氮浓度呈显著或极显著相关.不同基因型间硝酸盐还原酶活性差异显著,其中不耐氮肥基因型8136、红花大金元的硝酸盐还原酶活性明显高于其它品种,其叶绿素含量、根系活力及氮含量也高于其它品种,但其生物量随氮浓度的升高而降低;而较耐氮肥的基因型中烟90、KY17则与之相反.     

土壤施硒对白肋烟含硒量的影响

盆栽试验结果表明,在本试验设定的土壤施硒范围内,白肋烟叶、根、茎的含硒量分别为3.8~210、2.2~57、1.4~42μg/g,呈叶 > 根 > 茎的分布规律,而且均与土壤施硒量呈极显著的正相关;白肋烟叶、茎、根的吸硒量分别为0.208~11.343、0.143~3.682、0.032~1.000 mg/pot,呈现叶 > 茎 > 根的分布规律,亦均与土壤施硒量呈极显著的正相关:叶、茎、根的吸硒量占烟株总吸硒量的比例分别为54.3%~70.8%、20.8%~37.5%、5.5%~9.5%,说明白肋烟的硒积累能力为叶 > 茎 > 根;白肋烟对土壤施硒的回收率为8.9%~18.1%。      

基于主成分分析的芹菜品质评价

为完善芹菜品质评价体系,对13个适宜食用时采收的品种的14项品质和生理生化指标进行测定。分析芹菜各指标间的相关性,采用主成分分析法建立芹菜品质的评价模型,对芹菜品种的品质进行综合评价。结果表明,芹菜品种间的品质和理化特性存在一定差异,a^*值与叶绿素含量呈极显著负相关(P<0.01);V_C与叶柄硬度呈极显著正相关(P<0.01),与叶绿素和总糖含量、过氧化物酶(peroxidase,POD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)活性均呈显著正相关(P<0.05);硬度与总糖、纤维素酶活性呈极显著正相关(P<0.01),总糖与POD活性呈显著正相关(P<0.05),与纤维素酶活性呈极显著正相关(P<0.01)。通过主成分分析法分别提取出叶绿素含量、总糖含量、可食率、PAL活性、硬度、膳食纤维含量和汁液损失率共7项关键指标,建立了基于主成分分析的综合数学模型F=0.388F₁+0.238F₂+0.143F₃+0.134F₄+0.098F₅。据此计算综合得分并排序确定品质较好的品种分别为\