烟草CYP82E4v1基因调控降烟碱的生物合成

为明确烟草烟碱去甲基酶基因CYP82E4v1在降烟碱生物合成中的调控作用,通过农杆菌介导,将含CYP82E4v1超量表达的植物表达载体pLF-35S-CYP和干涉表达的植物表达载体pLF-35S-CYPi分别遗传转化烟草品种K326,共获得转基因植株61株,其中超量表达植株42株,干涉表达植株19株。HPLC测定表明,超量表达植株降烟碱含量比对照烟草品种K326高88.9%,而干涉表达植株降烟碱含量比对照烟草低61.1%,表明CYP82E4v1的超量表达能提高烟草降烟碱含量,该基因的表达受到抑制时降烟碱合成受阻。Real-Time PCR分析结果表明,超量表达植株中CYP82E4v1基因的表达为对照烟草的20倍以上,在干涉表达植株中其表达量仅为对照烟草的6%。同时,在干涉表达植株中其他降烟碱合成基因,如CYP82E5v2和CYP82E10等也受到不同程度的抑制。此外,在构建植物表达载体时,引入衰老基因SAG12启动子驱动重组酶基因FLP的"Gene-deletor"表达元件,在烟草叶片发育后期以清除转基因植株中外源GUS∷NPT II基因,从而获得了降烟碱含量低且不含筛选标记基因的转基因烟草植株。     

烟叶衰老过程中类胡萝卜素代谢及相关基因表达分析

成熟叶片中类胡萝卜素含量与烟叶品质密切相关。为探究烟草叶片衰老过程中类胡萝卜素组分变化及代谢相关基因表达情况,本研究以普通烟草红花大金元为材料,采用液相色谱法测定不同发育时期烟叶中新黄质、叶黄质和β-胡萝卜素的含量;通过转录组数据分析结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法,分析烟草叶片衰老成熟过程中类胡萝卜素代谢相关基因的表达变化。结果显示,烟草进入成熟衰老期叶片中新黄质、叶黄质、β-胡萝卜素含量逐渐降低;类胡萝卜素合成基因GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和LYCE呈现下调表达,类胡萝卜素降解基因LOX、POD和CCD1呈现上调表达,PAL和PPO呈现下调表达。类胡萝卜素转化基因ZEP、NXS、NCED呈上调表达。类胡萝卜素合成相关转录因子基因ORANGE、HY5、COP1、DET1呈现下调表达,而MYB5b、Cry-2呈现上调表达。随着烟叶成熟衰老,类胡萝卜素合成减弱,而降解增强。研究结果为烟叶成熟衰老过程中类胡萝卜素代谢的分子调控及针对类胡萝卜素含量定向改良烟草品种奠定了基础。     

硃砂烟CYP82E4基因表达模式及烟碱转化率分析

为解析硃砂烟基本特征特性, 以“硃砂2号”为研究材料, 调查其田间农艺性状及硃砂烟叶产出规律, 通过qPCR分析CYP82E4基因表达模式, 并检测硃砂烟叶生物碱含量。结果表明, 硃砂2号农艺性状与云烟87无显著差异, 烤后硃砂烟叶比率随着叶位增高逐步上升。硃砂2号烟叶中CYP82E4基因高水平表达, 导致大量烟碱被转化生成去甲基烟碱, 浅红、中等红色、深红三种类型硃砂烟叶的烟碱转化率分别为86.95%、90.86%、93.85%, 远高于云烟87的5.12%。硃砂烟子代植株中CYP82E4基因高表达、高烟碱转化率性状能够稳定遗传, 烤后烟叶均呈现明显的硃砂烟外观特征。本研究揭示了硃砂烟基本特征特性, 为进一步研究硃砂烟的成因及化学特性提供理论支撑。      

烟碱生物合成分子机制的研究进展

烟碱是烟草主要的生物碱,其生物合成受烟株生长时期、激素水平、生物和非生物胁迫等诸多因素的调控。从烟碱生物合成途径及相关酶、参与烟碱合成的调控因素、用于解析烟碱生物合成相关基因的方法等方面,综述了有关烟碱生物合成代谢的分子机制及其调控的研究进展,旨在为烟碱生物合成的基因调控、代谢工程提供参考。     

烟碱转化为去甲基烟碱的原理研究与遗传资源开发

转化是用来描述烟草合成和贮藏尼古丁过程的术语，尼古丁是烟草中存在的主要生物碱形式，在叶片衰老和烘烤过程中，尼古丁的很大比例转化成N-去甲基化合物-去甲基烟碱，转化是一种显性性状，且具有不可逆转的特性，能使植物积累去甲基烟碱达到总烟碱量的90％。转化是白肋烟的一个特殊问题，有些品种世代间转化率可高达20％。去甲基烟碱是N’-亚硝基去甲基烟碱（NNN）的前体物，N’-亚硝基去甲基烟碱（NNN）属于烟草特有亚硝胺，就烟草而言，科学家对降低去甲基烟碱的合成方面的研究有很大的兴趣。对控制转化过程基因的了解，有助于形成新的排除白肋烟中去甲基烟碱的对策，并能从分子水平上理解去甲基烟碱的生成。新的强大的基因组技术将加快农艺学重要基因的鉴定和特性描述。为鉴定转化过程的基因资源，我们利用来源于烟草衰老叶片转化特性的等位基因的cDNA文库构建了一个表达序列标签（EST）数据库，EST数据库基因微阵表达分布，提供了鉴定尼古丁转化基因的新的机会。     

烟草CYP82E4基因启动子功能分析

烟碱转化是指在烟叶成熟期,烟叶中的烟碱大量转化成降烟碱,烟叶品质发生显著变化的过程。前期研究表明烟碱转化由烟碱去甲基酶一步催化完成,其编码基因为CYP82E4(NtE4)。为解析NtE4启动子功能,探究其调控机制,本研究通过在线数据库分析NtE4启动子上的顺式作用元件,预测其上游靶向转录因子;通过5’端缺失构建启动子融合GUS基因的重组表达载体并瞬时转化本氏烟,确定启动子活性区域。结果表明,NtE4启动子包含2个脱落酸、11个乙烯响应元件,9个WRKY和7个NAC结合位点等;-500～-1 000 bp是NtE4启动子核心区域,-500～-1 967 bp存在较多增强启动子活性的元件;预测ERF、WRKY和NAC为NtE4基因上游靶向转录因子;荧光定量表达分析显示ERF5、WRKY50和NAC29在叶片衰老过程中具有和NtE4相似的表达趋势。本研究将为阐明烟叶衰老过程中NtE4介导的烟碱转化机制提供理论依据。     

不同品种烤烟衰老期碳氮代谢及相关基因表达的差异分析

  目的  研究不同品种烤烟叶片衰老期碳氮代谢及相关基因表达的差异及关系。  方法  以田间成熟落黄表现不同的4个烤烟品种中部叶为材料,分析叶片成熟衰老过程中质体色素、碳氮代谢中间产物含量的变化,检测了相关基因的表达量。  结果  ① 豫烟10号叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量较低,并随着叶龄的增加降低的幅度最大,CCD表达量较高,NC89的降低的幅度较小,含量较高,CCD表达量较低。②叶片淀粉含量在叶龄50~60 d时达到峰值后开始下降,从峰值到叶龄70 d,降幅较大的豫烟10号（38.65%）,淀粉合成相关基因GBSS1和SBE的表达量相应较低,总糖和还原糖含量从峰值至叶龄70 d也表现较大的降幅。③ NC89的淀粉、总糖、还原糖和总碳含量均相对较高,云烟87和K326的碳代谢指标则居豫烟10号和NC89之间。④豫烟10号叶片成熟衰老过程中总氮、碳氮比、烟碱含量显著低于NC89,这与豫烟10号氮素转移相关的GS1-3基因表达量在叶龄40 d之后显著高于NC89,参与氮同化相关的GS2、GDH1和NR基因表达量相对较低的特征一致。  结论  叶片衰老速度快的品种具有淀粉合成代谢弱,淀粉含量较低,氮素同化代谢较弱而再利用和再转移代谢能力较强,总氮、碳氮比较低的碳氮代谢特征。      

外源EBR对烤烟成熟期氮代谢及烟碱代谢的影响

为探明外源2, 4-表油菜素内酯（2, 4-epibrassinolide,EBR）对烤烟成熟期氮代谢及烟碱代谢的影响,以清水为对照,比较了烤烟打顶后叶面喷施和灌根两种EBR施用方式下成熟期叶片光合特性、干物质积累、氮代谢相关酶活性、烟碱代谢相关基因表达量和烤后烟叶化学成分的差异。结果表明,与对照相比,叶面喷施和灌根两种EBR施用方式均可提升成熟期烟株的光合能力,增加烟株各部位的干物质积累量,显著提升中部和上部烤后烟叶总氮和烟碱含量（质量分数）,且叶面喷施处理的效果好于灌根处理。两种施用方式上部叶氮素吸收同化关键酶NR和GS活性显著高于对照处理,叶面喷施处理叶片中氮同化相关基因NtGS2、NtGDH1和NtNR的相对表达量显著高于对照和灌根处理。两种EBR施用方式烟株不同部位烟碱合成基因NtQPT、NtPMT和转运基因NtJAT1、NtJAT2和NtNUP1的相对表达量均极显著高于对照,且叶面喷施处理叶片中烟碱合成与转运基因的表达量均极显著高于对照和灌根处理。因此,外源EBR可促进烟株的生长发育、提高氮代谢及烟碱代谢水平,增加中部和上部烤后烟叶烟碱含量,叶面喷施的效果好于灌根。      

基于非靶向代谢组学的红花大金不同生育期烟叶代谢图谱差异分析

  目的  为分析不同生育期烟草烟叶代谢图谱差异。  方法  以烟草品种红花大金元为研究对象,采集团棵期、现蕾期和成熟期烟叶样品,利用LC-QTOF/MS进行代谢指纹图谱检测,利用统计分析方法对差异代谢物进行筛选,基于Spearman相关分析计算代谢物之间的相关性系数,利用MetaboAnalyst软件进行代谢通路富集分析。  结果  （1）不同生育期烟草样品代谢图谱存在明显差异,共鉴定出245个差异代谢物,其中类黄酮、有机酸、氨基酸、核苷、生物碱、脂类等物质种类最多。（2）烟碱及其衍生物,如烟碱-1-氧代、麦斯明、假木贼碱、马钱子碱、新烟碱、2, 3'-二联吡啶,均随烟草生育期而逐渐累积,而与烟碱合成相关的前体物质,如精氨酸、亚精胺、腐胺、羟基丁酸等,均随着生育进程逐渐减少,且与烟碱含量显著负相关。（3）与次级代谢物合成相关氨基酸和有机酸等物质在团棵期或现蕾期含量较多,而在成熟期含量较低,与成熟期次级代谢物合成有关。（4）大部分类黄酮和酚酸组分在成熟期时含量较高,可以提高烟草抗病和抗逆能力。（5）相关性分析发现,烟碱含量与谷氨酸、泛酸、吡哆醛、蜜二糖、3-羟基邻氨基苯甲酸和顺式玉米素-o-葡萄糖苷等物质显著正相关,可能是调控烟叶中烟碱含量的重要标志物。  结论  基于代谢组学揭示了不同生育期烟草代谢物变化规律,为优质烟草育种及品质分析提供技术支撑。      

云南清香型烤烟质体色素合成规律研究

以K326为试验材料研究了云南烤烟叶片发育过程中叶绿素和类胡萝卜素含量变化规律,及其生物合成途径中关键酶基因表达变化规律。结果表明:在叶片发育早期,质体色素含量逐渐升高,其合成关键酶基因表达活跃,合成过程占据优势;从30 d叶龄开始,质体色素含量进入了缓慢下降时期,相关基因表达减弱,合成受阻;从70 d叶龄开始,质体色素含量急剧下降,但合成关键酶基因的表达并未出现陡降现象。表明30 d叶龄和70 d叶龄是质体色素代谢调控的关键时期。     

烟草叶片衰老相关基因

烟草（Nicotiana tabacum L.）是一种叶用经济作物,以成熟变黄的叶片为收获对象,其叶片成熟度和叶片变黄过程对烟叶产品的质量起到决定性的影响。简述了植物叶片衰老相关基因的研究概况,归纳了近年来烟草中叶片衰老调控相关基因的研究进展,总结了部分外源基因对烟草叶片衰老的影响。分析表明,研究烟草叶片衰老相关基因,对提高烟叶品质和烟草育种具有重要意义。     

过表达三七PnSS基因对烟草萜类物质含量及生长发育的影响

为明确PnSS基因在调节烟草萜类物质含量中的作用,构建了PnSS基因过表达载体,并通过叶盘法转化烟草品种巴斯玛14号,获得了PnSS基因过表达烟草植株,最后利用HS-SPME-GC/MS分析转化烟草叶片中的香味物质含量（质量分数）。结果表明：(1)PnSS的氨基酸序列与其在烟草中同源物NtSS具有81.9%的一致性,并含有角鲨烯和植烯合成酶结构域。(2)PnSS基因的过表达导致烟草植株变矮、叶片变小;与根和茎相比,叶片中PnSS基因表达量最高。(3)PnSS基因的过表达使烟叶中乙酸、糠醇、4,6-二甲基嘧啶、苯乙醛、3,5-二甲基苯甲醛、二烯烟碱、二氢猕猴桃内酯、2-甲基吡嗪、壬酸、异戊醛、2-甲基丁醛、西松烯和烟碱13种香味物质含量增加,2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、2,3-联吡啶、植醇、苯乙醇、新植二烯、苯甲醛和麦斯明7种香味物质含量降低。因此,过表达PnSS基因会抑制烟草植株的生长发育并改变烟叶中萜类物质等香味物质的含量。     

AtPAP1基因在烟草中的表达

AtPAP1(Arabidopsis thaliana production of anthocyanin pigment 1)是拟南芥花青素生物合成途径中的关键调控基因。为实现花青素在烟草中的表达,利用烟草腺毛特异表达启动子pro CYP71D16,构建At PAP1特异表达载体p CAMBIA1391-CYP71D16-PAP1,并将其与载体p CAMBIA1391-35S-PAP1通过农杆菌介导法进行烟草遗传转化,对所得的转基因烟株进行分子检测和表型观察,同时测定转基因烟叶中花青素的含量。结果表明:35S::At PAP1烟株叶片表面呈红色,腺头呈绿色,腺柄细胞无色;CYP71D16::At PAP1烟株叶片表面呈绿色,叶片分泌型腺毛的腺头呈明显粉红色;对照烟草叶片及叶面腺毛均呈绿色。HPLC检测结果表明,在35S::At PAP1转基因烟株中发现有矢车菊色素和天竺葵色素的积累;在CYP71D16::AtPAP1转基因烟株中仅发现矢车菊色素有少量积累;对照烟株中没有检测到花青素。本研究中实现了At PAP1基因在烟草中的表达,为研究烟草物质代谢提供了理论依据。     

不同烤烟品种烟叶衰老特性与内源激素的关系

为明确不同烤烟品种烟叶衰老特性与内源激素变化的关系,以田间成熟落黄表现不同的4个烤烟品种(豫烟10号、云烟87、K326和NC89)中部叶为材料,分析了不同品种叶片发育成熟过程中叶绿素含量(质量分数)、衰老标志基因、内源激素含量及相关基因表达量的变化。结果表明:在豫中烟区常规大田栽培条件下,随着烟株叶龄的增加叶绿素含量逐渐降低,烟叶衰老程度加剧,脱落酸(ABA)含量升高,赤霉素(GA3)、生长素(IAA)和细胞分裂素(CTK)含量降低。豫烟10号品种中部叶衰老速度较快,云烟87和K326居中,NC89衰老速度较慢。与NC89品种相比,豫烟10号品种中部叶随着叶龄的增加,ABA含量保持在较高水平,而延缓衰老的GA3、CTK和IAA含量指标均较低,衰老上调标志基因CP1和CP23的表达量较高,衰老下调表达基因PSA1和MC的表达量较低,分别调控乙烯、ABA和茉莉酸的相关基因NtEFE26、NtNCED1和NtPR1b表达量均较高,水杨酸应答基因NtCHN50的表达量较低。烤烟品种烟叶衰老特性差异与自身的激素代谢密切相关,成熟落黄快的品种表现出ABA、乙烯和茉莉酸代谢旺盛的特点。     

烟草茉莉素信号途径相关基因

茉莉素途径是植物重要的信号途径,对植物的生长发育过程和抗逆过程起重要的调控作用。有生物活性的茉莉酸衍生物JA-Ile(jasmonoyl-isoleucine)与茉莉素受体复合体SCFCOI1结合后,导致茉莉素途径负调控因子JAZ蛋白由26S蛋白酶体(即蛋白泛素化降解途径)降解,并释放出茉莉素途径转录激活因子MYC2,从而激活茉莉素信号途径下游与植物生长发育相关和抗逆相关的功能基因表达和生理变化。对该信号途径中3个重要基因COI1、JAZ、MYC2在烟草中的研究情况进行了综述。     

烟草查尔酮异构酶基因2(NtCHI2)功能分析

烟草查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是黄酮类代谢的一个关键酶,烟草中有两个基因拷贝(NtCHI1、NtCHI2),相关研究多集中在NtCHI1基因,对NtCHI2的研究较少。为研究烟草NtCHI2的功能,主要以NtCHI2的过表达和干扰植株叶片为材料,进行了实时定量PCR和CHI活性分析以及芸香苷含量检测,同时进行了NtCHI2体外表达蛋白的酶活分析。结果表明:NtCHI2体外表达蛋白具有查尔酮异构酶活性;过表达株系中NtCHI2的表达量升高5～75倍,但CHI酶活性和芸香苷含量基本没有变化;干扰株系中NtCHI2的表达量降至70%,CHI酶活性和芸香苷含量分别降低50%和90%。烟草NtCHI2参与芸香苷的合成代谢调控,在一定程度上NtCHI2基因的表达量和芸香苷的含量正相关。     

光强衰减对烟草叶片碳氮代谢关键基因表达的影响

通过电子显微镜和反转录 PCR方法研究了烟草在遮光处理(分别为 100%, 85%, 70%和 55%的自然光照强度)下烟叶移栽后 78天、85天、105天及 120天(采收当天)四个时期淀粉的积累和淀粉、糖、氮代谢途径关键基因表达量的变化。结果表明,移栽后 105天烟叶生理成熟期之前淀粉含量受光照影响最大,随着光的衰减含量逐渐降低。葡萄糖转化及蔗糖的合成途径中有 4个关键基因表达量随光强减少逐渐降低,且随着烟草的成熟也呈下降趋势。淀粉合成酶基因 GBSSI在叶片扩展期表达较弱,在叶片成熟期大量表达,随着光照强度的减弱表达量稍有减小。氮代谢途径关键基因 Nir、GS等同工酶基因的表达存在一定的互补性,总体基因表达趋势为随光强的减弱表达量逐渐增加,表明在弱光下烟叶氮代谢滞后。      

烟草CYP71D亚家族的生物信息学分析

细胞色素P450（CYP450）是一类超基因家族编码的多功能氧化酶,在生物合成、代谢解毒及植物防御方面具有重要作用。其中CYP71D属于CYP450的一个亚家族,主要在次生代谢物合成和病虫害防御方面起作用。为了更好地了解烟草CYP71D亚家族基因特征和功能,本研究利用生物信息学分析手段及烟草转录组数据,对CYP71D亚家族基因的结构和表达等进行了分析。结果发现,在烟草中共有42个CYP71D亚家族成员,各成员在染色体上并非均匀分布,其氨基酸长度和等电点差异较大,但基因结构、保守结构域数目和分布高度一致;二级结构分析表明,烟草CYP71D亚家族成员具备P450蛋白特征结构域;基因表达模式分析显示,多数CYP71D基因在根、叶、花中特异表达,大部分基因参与了IAA激素、黑胫病、温度等逆境胁迫反应。这为烟草CYP71D亚家族基因功能的深入研究及烟草抗逆品种的培育奠定了基础。     

生长和烘烤过程中烟叶抗性淀粉含量的变化

为降低烤后烟叶淀粉含量（质量分数）和调控烟叶抗性淀粉的合成,以云烟87为试验材料,分析了烟叶抗性淀粉含量的变化趋势、抗性淀粉含量与直链淀粉含量的相关性以及烟叶淀粉合成相关基因的表达量。结果表明：在烟草生长发育过程中,烟叶总淀粉、抗性淀粉含量整体呈上升趋势,其中烟草生长发育中后期是抗性淀粉积累的主要时期。烟叶抗性淀粉含量与直链淀粉含量呈极显著正相关（r=0.992**,P<0.01）;在烘烤过程中,变黄期是烟叶中抗性淀粉和非抗性淀粉降解的主要时期。烘烤过程中抗性淀粉的降解比例较低,烟叶抗性淀粉和直链淀粉含量呈显著正相关（r=0.918*,P<0.05）;在烟草生长发育过程中淀粉合成相关基因AGPS2、AGPS3、AGPL、SS2、SBE1、ISA3、GBSS和SBE2的表达量基本呈现稳定或持续增加的趋势,其中GBSS和SBE2基因的表达量变化趋势与直链淀粉和抗性淀粉含量的变化趋势一致。GBSS1和SBE2可能是调控直链淀粉和抗性淀粉含量的关键基因。     

仿生型信号分子对烟草主要生物碱的抑制作用

用源于取食烟草的寡食性昆虫口腔分泌物的仿生型信号分子(BSM)在不同条件下、对不同类型烟草在打顶后进行涂抹处理,并用HPLC检测BSM处理株和对照株烟草主要生物碱的含量,分析探讨BSM在不同条件下对烟草生物碱的调控作用。结果表明:BSM物质对不同类型烟草打顶后叶片上生物碱的积聚有不同程度的抑制作用。BSM对烤烟9717中降烟碱的影响最大,中部和上部分别降低55.78%和63.40%,上部叶各生物碱降幅均大于中部叶,其中烟碱和总生物碱分别降低25.49%和26.28%。BSM浓度对白肋烟中生物碱的抑制效应也有影响,0.1mol/L的BSM对烟碱的影响最大,中、上部叶的降低率分别达22.99%和42.45%,总生物碱则分别降低22.21%和37.73%;0.2mol/L的BSM可使降烟碱的量显著降低,中部和上部叶分别降低62.94%和58.53%。施氮量对BSM的调控作用也有影响,在高的施氮量(9kgN/667m2)下抑制作用更大,可使K326上部叶总生物碱降低34.76%。