BABA诱导烟草抵御镉胁迫初步研究

通过施加外源BABA来减轻镉胁迫对烟草的毒害,并从抗氧化系统、离子含量及相关基因表达来探讨其作用机理。结果表明:0.2 mmol/L BABA和0.5 mmol/L BABA能使镉胁迫下的烟苗根长、鲜重及叶绿素含量显著增加;外源BABA处理不仅能显著提高镉胁迫下烟苗脯氨酸、谷胱甘肽(GSH)、还原型抗坏血酸(As A)、可溶性糖和总酚含量,还能增强超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸还原酶(APX)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,降低过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量,可以促进烟苗根部镉的积累及降低地上部镉的含量。实时定量PCR结果表明:BABA参与Nt IRT1、Nt Nramp5、Nt PCS1、Nt GSH1、Nt HMA4、Nt PCR1、Nt PDR5b基因表达调控。综合来看,BABA缓解烟草镉胁迫可能是激发植物体抗氧化系统、降低地上部镉的积累及调节相关基因表达的综合结果。     

两个烟草Nup96基因的分子克隆及其表达分析

为研究烟草低温早花的分子机理,采用RT-PCR结合RACE法,从烟草品种NC82中克隆到2个Nup96基因c DNA全长序列,分别命名为Nt Nup96a和Nt Nup96b,Gen Bank登陆号分别为KU558693和KU558694。序列分析表明2个基因均编码1037个氨基酸残基的蛋白,氨基酸序列一致性为97%,与拟南芥Nup96蛋白(NP_178183)的序列一致性为60%;2个基因编码蛋白具有典型的植物Nup96结构特性,包含1个Nup96结构域和1个自酶解结构域。荧光定量PCR分析表明:在正常的生长条件下,Nt Nup96a和Nt Nup96b在烟草各组织中均有表达,在叶片中的表达量较弱,且随着植株生长其表达量显著下降;在12℃处理10天后,在烟草叶片中2基因的表达都出现了明显的下调,这一结果提示Nup96可能是烟草开花时间调控的抑制因子,其受低温诱导下调表达可能与NC82低温敏感,易早花特性相关。     

不同Cd积累基因型烟草中Cd的亚细胞分布及化学形态

采用苗期水培试验,以Cd积累模式不同的两个烟草基因型普通烟草品种K326(根系和叶片积累)和黄花烟草品种N.rustica(根系积累)为试材,比较了不同Cd浓度下(1 μmol/L和50 μmol/L)两个基因型烟草根系和叶片中Cd的亚细胞分布和化学赋存形态.结果表明:①Cd浓度1μmol/L时,K326表现为根系和叶片积累,N.rustica以根系积累为主;高Cd浓度下两者均显示根系积累特性.②Cd浓度1 μmol/L时,K326和N.rustica中Cd主要结合于可溶组分中,且两个基因型烟草中Cd在可溶组分中的积累比例高低与相应部位Cd积累总量大小相一致.表明Cd在可溶组分中截留比例可能是造成普通烟草和黄花烟草Cd积累特征不同的影响因素之一.③两个基因型烟草根系中Cd以乙醇提取态为主,叶片中Cd主要以氯化钠结合态和去离子水结合态存在.提高Cd处理浓度,Cd存在由活性强的化学形态向活性弱的形态转化的趋势.但在两基因型烟草中Cd的化学形态没有明显的的种间差异,表明两基因型烟草对Cd积累的差异与其化学赋存形态关系不大.     

烟草高亲和硝酸盐转运蛋白基因NtNRT2.5的克隆及表达模式分析

【背景和目的】高亲和硝酸盐转运蛋白NRT2家族基因在植物硝酸盐吸收转运和再利用过程中发挥重要作用,为探索烟草NRT2家族基因NtNRT2.5对烟草氮素调控的作用。【方法】从烟草烤烟品种K326中克隆得到高亲和硝酸盐转运蛋白基因NtNRT2.5,进行生物信息和表达模式分析,创制NtNRT2.5启动子融合GUS报告基因的K326转基因烟草材料,进行GUS组织化学染色。【结果】NtNRT2.5基因的全长ORF为1509 bp,编码502个氨基酸,属于稳定性疏水蛋白,其蛋白跨膜结构域具有NRT2家族结构特征;烟草NtNRT2.5蛋白与拟南芥AtNRT2.5蛋白亲缘关系最近,功能相似;该基因启动子包含多种激素和胁迫响应元件;NtNRT2.5蛋白定位于细胞质膜;NtNRT2.5基因在烟草各组织都有表达,在下部叶中表达最强,且受低氮诱导表达增强,GUS组织染色结果表明,正常供氮和低氮条件下,在转基因烟草的根（中轴）和下部叶片（叶脉）中都检测到了GUS报告基因,均能显蓝色,且低氮条件下表达更加强烈,蓝色更深。【结论】烟草NtNRT2.5是高亲和硝酸盐转运蛋白的编码基因,该基因受低氮诱导表达增强,可能参...     

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.5基因的克隆及功能分析

【背景和目的】低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1家族基因在植物吸收和转运硝态氮过程中发挥重要作用,为研究烟草NRT1家族基因在烟草氮素利用中的作用。【方法】从栽培烟草品种K326中克隆获得NtNRT1.5的全长cDNA序列,利用生物信息分析、qRT-PCR技术和转基因技术系统分析NtNRT1.5基因的序列特征、表达模式及在提高烟草氮素利用效率方面的功能。【结果】NtNRT1.5全长序列包含1800bp开放阅读框、编码599个氨基酸,编码的蛋白质具有NRT基因家族的共有结构特征,与拟南芥AtNRT1.5相似性达到59.28%。亚细胞定位结果表明NtNRT1.5蛋白定位在细胞膜上,其启动子中包含多个与硝酸盐（A(C/G)TCA）、胁迫（MYB）、根系特异表达（ROOT MOTIF BOX）相关的响应元件。表达模式分析结果表明NtNRT1.5主要在根部表达,其次是衰老叶片和茎,新叶基本不表达;低氮抑制其在根系中的表达,说明NtNRT1.5主要负责正常条件下的硝酸盐的吸收;低氮条件下,NtNRT1.5过表达显著提高了转基因烟株的氮素利用率。【结论】NtNRT1.5基因在烟草氮素的吸收和转运上行使重要...     

不同吸镉能力油菜各器官累积镉的差异

对筛选出的高吸镉能力和低吸镉能力油菜品种进行全生育期土培盆栽实验,研究两个油菜品种各器官吸收累积镉特征及体内镉分配差异。试验结果表明,两个不同吸镉能力油菜品种全生育期地上部总吸镉量与苗期地上部吸镉量高低一致,地上部不同器官累积镉量两个品种存在显著差异。随土壤镉含量的增加,高吸镉能力油菜朱苍花籽地上部吸收的镉主要转运至叶中,而低吸镉能力油菜川油Ⅱ-93则主要转运至茎中。在土壤镉含量大于1mg·kg^-1时,高吸镉能力油菜籽粒中镉含量显著高于低吸镉能力油菜,当土壤镉含量小于lmg·kg^-1时则相反。两个油菜品种地上部吸收的镉主要累积在茎和叶中,各器官中镉含量两品种均表现为叶〉茎〉角果壳〉籽粒。     

烟草硝酸盐转运蛋白基因NtNRT2.4的克隆及表达分析

植物NRT2基因家族(高亲和硝酸盐转运蛋白基因)在植物吸收和转运硝酸盐过程中发挥重要作用。本研究根据NRT2基因家族的保守序列设计兼并引物,扩增出一条821bp序列,以此序列为信息探针,通过电子克隆和RT-PCR的方法从烟草中克隆获得一个包含1593bp开放阅读框、编码530个氨基酸的c DNA序列,命名为Nt NRT2.4。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质具有NRT家族的共有结构特征,与烟草已发现的三个本家族基因同源性达到77.54%,与拟南芥NRT2家族基因同源性达到81.63%,其启动子中包含多个与硝酸盐、光照及根系特异表达相关的元件;组织特异表达分析结果显示,烟草Nt NRT2.4基因的组织表达差异较大,在根部的表达量较高,在叶片和茎部的表达量低;不同氮素形态、光照和蔗糖处理下的基因表达分析结果表明,硝态氮、光照和蔗糖处理诱导Nt NRT2.4表达,而铵态氮抑制其表达。     

烟草NtCycB2启动子的克隆和组织驱动特性分析

【背景和目的】烟草B型细胞周期蛋白CycB2可以负调控腺毛的发生，为分析烟草Nt CycB2启动子的组织驱动特性。【方法】通过实时定量PCR分析普通烟草NtCycB2-1和Nt CycB2-2两种序列的组织表达差异，克隆NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子序列，对其进行进化分析、顺式元件预测和组织驱动特性分析。【结果】（1）烟草NtCycB2-1和NtCycB2-2均为腺毛优势表达基因，NtCycB2-1的表达量显著高于NtCycB2-2;(2)普通烟草中存在两种NtCycB2启动子序列类型（ProNtCycB2-1和ProNtCycB2-2），其中ProNtCycB2-1来自于林烟草，ProNtCycB2-2来自于绒毛烟草，这些CycB2启动子中普遍存在ABRE等激素应答元件，以及MYB-motif、MYC-motif和TC-rich repeats等逆境响应元件；（3）以GUS为报告基因，研究NtCycB2-1和NtCycB2-2两个启动子的组织驱动特性发现，NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子均能驱动GUS基因在叶片和茎部腺毛中特异表达，其中NtCycB2-1启动...     

不同Cd积累基因型烟草根系分泌低分子量有机酸的差异

采用土壤盆栽和水培试验,以不同Cd积累模式的两种基因型烟草[普通烟草品种K326和黄花烟草(N.rustica)]为试材,研究了不同镉浓度处理下烟草根系分泌的低分子量有机酸总量及各组分含量差异。结果表明:①土壤盆栽试验中,1 mg/kg镉处理可促进烟苗生长,10 mg/kg镉处理严重抑制烟苗生长。与K326相比,N.rustica具有更强的耐镉性。②土壤盆栽和水培试验中,低浓度镉处理可促进低分子量有机酸的分泌,高浓度则抑制其分泌。N.rustica低分子量有机酸的分泌总量大于K326。镉处理下,黄花烟草分泌较多的低分子量有机酸可能是其耐镉的主要生理机制之一。③土壤盆栽和水培试验中,N.rustica根系分泌的草酸、酒石酸、甲酸和乳酸含量均高于K326,但这4种有机酸占有机酸总量的比例两烟草基因型间差异均不显著。两基因型烟草的耐镉性差异可能与这4种低分子量有机酸的分泌量有关,而与各有机酸的组成比例无关。     

烟草E3泛素连接酶NtHOS1a和NtHOS1b基因的克隆与表达分析

为明确与烟草低温早花有关的调控基因,利用生物信息学方法结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆了2个E3泛素蛋白连接酶HOS1基因cDNA全长序列,分别命名为NtHOS1a(Gen Bank登录号:KU558689)和NtHOS1b(Gen Bank登录号:KU558690)。NtHOS1a基因全长为3 599 bp,编码963个氨基酸;NtHOS1b基因全长为3 578 bp,编码954个氨基酸;两基因氨基酸序列的一致性为95%,与拟南芥HOS1蛋白(NP_181511)的序列一致性分别为51%和50%。两基因编码蛋白的N末端均含有一个E3泛素连接酶特征的环指结构域。荧光定量PCR分析表明:在正常生长条件下,NtHOS1a和NtHOS1b在烟草根、茎、叶中表达强烈,12℃低温处理10 d后两基因在烟草根、茎、叶中的表达量均有不同程度的降低,说明在烟草根、茎、叶组织中NtHOS1a和NtHOS1b的表达量受低温胁迫的负向调控。     

烟草对镉的吸收积累特性及镉的化学形态分布

为明确烟草对重金属镉(Cd)的吸收积累特性及其化学形态分布特点,采用水培试验研究了烟草对Cd的吸收特性,以及在不同Cd浓度下烟草根茎叶Cd含量(质量分数)及其化学形态分布。结果表明,烟草对Cd的吸收量随着Cd处理时间的推移呈现先降低后升高的趋势,达到240μg·株~(-1)时趋于稳定,之后又有所降低。烟草对Cd的吸收速率则呈现高-低-高的变化趋势,烟草移栽入含Cd培养液中4~5 h时,对Cd吸收速率最高。随着Cd处理浓度的增加,烟草干物质的积累量先升高后降低,低浓度Cd处理的烟草干物质量增加。不同Cd浓度处理,烟草不同部位Cd含量排序依次为茎根叶,且随着Cd浓度的增加各部位的Cd含量均增加。烟草根系中Cd以去离子水提取态为主,其次为醋酸提取态,叶片中Cd主要以醋酸结合态存在。Cd处理浓度提高时,烟草中Cd由活性弱的化学形态向活性强的形态转化。     

编辑烤烟多酚氧化酶基因NtPPO8后的效应分析

【目的】探究NtPPO8基因在烟草中的功能以及对烟叶耐烤性和烤后烟质量的影响。【方法】以烤烟品种NC89为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtPPO8进行定向编辑,获得纯合突变植株,测定并分析原品种和突变体在叶龄60 d时的基因表达量和植物多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性差异,探究NtPPO8基因对烘烤过程中的PPO活性以及烤后烟的多酚物质含量的影响。【结果】（1）共获得6株T0代纯合突变体,突变均发生在靶位点上,为1个碱基的插入突变。（2）4个T1代编辑株系的NtPPO8表达水平显著下降,所有编辑株系的PPO活性显著下降。（3）T1代编辑株系烘烤过程中的PPO活性低于原品种,烤后中部叶总酚含量显著高于原品种。【结论】定向编辑NtPPO8基因后,降低了其在烟叶中的表达量,抑制了烟叶在烘烤过程中的PPO活性,有助于烤后烟多酚类物质的积累。     

解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)源唾液酸醛缩酶基因的异源表达及其活性研究

为发掘新型唾液酸醛缩酶,使其在大肠杆菌中得到高效表达,本研究首次从菌株Pedobacter heparinus中克隆疑似编码唾液酸醛缩酶的PhNeuLy3300基因片段,并构建可自主表达异源蛋白的组成型表达载体pRSF-EM5。在此基础上将克隆的目的基因分别导入该pRSF-EM5载体和常用的诱导型载体pET-30a,构建重组质粒pET30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300,经大肠杆菌表达系统异源表达目的蛋白,并进一步对两种重组蛋白酶进行电泳分析和活性研究。结果表明:编码唾液酸醛缩酶的基因片段全长为945 bp,共编码314个氨基酸残基;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示两种重组蛋白表观分子量约为36.4 kDa,纯化后的pET30a-PhNeuLy3300重组蛋白浓度为3.29 mg/mL,证明经异源表达获得了两种重组目的蛋白酶;活性研究显示两种重组唾液酸醛缩酶均能在1 h内催化N-乙酰神经氨酸生成N-乙酰甘露糖胺,证明两种重组蛋白酶均具有较高的活性。     

烟草PPO基因家族鉴定与不同成熟度烟叶烘烤过程中PPO活性分析

【背景与目的】多酚氧化酶（PPO）参与的棕色化反应是生产高品质烟草产品的关键环节，为了明确烟草中PPO基因的结构与功能。【方法】通过生物信息学的方法鉴定烟草PPO基因家族成员及其特征；利用qRT-PCR方法分析了翠碧一号上部4种成熟度烟叶（M1～M4）PPO基因的表达，并采用多酚氧化酶活性检测试剂盒测定烘烤过程中烟叶PPO酶活性变化。【结果】烟草基因组中共鉴定到12个NtPPO基因，大多数成员具有类似的基因结构、相近的蛋白长度和保守的蛋白结构域。系统进化分析将菠萝、高粱、番茄、马铃薯和烟草的PPO蛋白分为3个亚族，其中Ⅱ，Ⅲ亚族中均为双子叶植物的PPO成员。NtPPOs基因家族成员的表达量随着成熟度提高表现出不同的变化模式，大多数成员在过熟烟叶中表达量最低。烘烤过程中不同成熟度烟叶中PPO活性也存在明显差异，其中M2、M3和M4成熟期烟叶PPO活性呈现先下降后上升再下降的趋势，在45℃达到最大值，且M2>M3>M4。【结论】研究结果可为烟草PPO基因的功能研究、烟叶棕色化的调控和品种遗传改良奠定基础。     

外源CBD缓解烟草Cd胁迫的代谢组学分析

【目的】探究外源大麻二酚（CBD）对镉（Cd）胁迫下烟草的缓解效应。【方法】以烟草品种K326为研究对象，施用乙酸镉，并将CBD喷施于Cd胁迫烟株叶面，测定各处理烟株Cd含量，并基于GC-MS和LC-MS/MS的靶向和非靶向组学方法分析烟株代谢物的差异。【结果】（1）CBD能提高烟株的Cd耐受系数，显著降低烟株地上部分的Cd积累量。（2）不同处理烟株代谢物存在明显差异，其中有15种初生代谢物、8种生物碱、12种植物激素差异显著。（3）施用CBD后，Cd胁迫下烟株根部的有机酸（苏糖酸、棕榈酸、丁二酸、乙醇酸、葡萄糖酸）、肌醇半乳糖苷、丙氨酸等初生代谢物含量减少；生物碱与植物激素合成趋于正常水平。（4）烟株中葡萄糖酸、乙醇酸、乳酸、肌醇半乳糖苷、甘油含量与烟碱呈正相关，其可能是重金属胁迫下，调控生物碱合成的潜在物质。（5）CBD可以调节烟株色氨酸、酪氨酸代谢等响应胁迫的代谢通路恢复正常，并通过调节硫代谢，改善植株对养分的吸收利用，使TCA循环等能量代谢通路恢复，保证烟草中生物碱类等特异性次生代谢物的稳定合成。【结论】外源CBD可通过改变代谢途径缓解烟株Cd毒害，为降低烟草重金属污染提供新途...     

茶叶CHS基因表达特性及其与儿茶素积累的关系

本研究用高效液相色谱法(HPLC)测定两种茶叶的儿茶素含量,通过RT-PCR克隆英红9号(YH)和南昆山毛叶茶(MY)的CHS基因进行比对分析,借助烟草瞬时表达技术对基因表达蛋白进行亚细胞定位;结合生物信息学分析选取特定肽段经人工合成后作为抗原制备CHS基因特异抗体;用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和Western blot技术测定比较两种茶叶CHS基因在转录、翻译水平的差异,并对比分析了两种茶叶间儿茶素含量差异与相应CHS基因表达的关系。结果表明:YH和MY中的儿茶素含量分别为181.51 mg/g和106.02 mg/g,前者显著高于后者并达到1.71倍;两种茶叶中所克隆的CHS基因具有单核苷酸差异但编码相同的氨基酸序列,其表达蛋白亚细胞定位于细胞质、细胞膜和细胞核;制备的CHS蛋白兔源抗体效价为1:80000;CHS基因在YH中的表达无论在转录水平还是在翻译水平均显著高于MY,前者分别是后者的3.9倍和1.7倍,两种茶叶中CHS合成酶基因在转录、翻译水平的表达均与其对应的儿茶素积累水平一致。实验研究证明,茶叶儿茶素积累水平与其合成通路关键酶基因CHS的表达呈正相关。     

烤烟品种对镉吸收累积敏感性差异研究

为分析烟草全生育期对镉（Cd）吸收、累积及分配的品种间差异,筛选低Cd吸收品种,通过盆栽土培法并外源添加cd,研究了不同Cd水平对10个烤烟品种生长和cd分布的影响。结果表明,Cd对烤烟生长的影响存在显著的品种差异,NC89、龙江851和翠碧1号的根系对Cd毒害反应较敏感,云烟85和豫烟3号的根系对Cd耐性较强,低、高Cd对烤烟叶片生长都有促进作用,且烤烟根系比叶片对Cd毒害的反应更敏感。烤烟不同器官中对Cd含量和积累量都存在显著的品种间差异,其中叶片Cd含量中烟100、翠碧1号、云烟87和豫烟3号较低;不同烤烟品种对土壤cd变化的敏感响应程度不同,中烟100、红花大金元和NC89对Cd敏感性较低。     

烤烟伸根期对低温胁迫的生理响应

【目的】研究低温胁迫对伸根期的烤烟生理特性的影响。【方法】采用盆栽方式,在人工培养箱中对耐冷性不同的烤烟品种红花大金元（低温不敏感型）和K326（低温敏感型）进行低温胁迫处理,研究不同低温胁迫时间烤烟的渗透调节物质、保护酶活性、多酚代谢、光合速率和光合色素等的变化情况,筛选出适用于烤烟耐冷性鉴定的指标。【结果】随低温胁迫时间的延长,烤烟的净光合速率和叶绿素耐冷系数呈下降趋势,下降速率与低温胁迫程度呈正相关,与品种的耐低温能力呈负相关;丙二醛和相对电导率耐冷系数在低温胁迫的前3 d随胁迫时间的延长呈上升趋势,上升速率与品种耐低温能力呈负相关;过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和可溶性蛋白、可溶性糖及总酚耐冷系数随低温胁迫时间的延长先升高后下降,低温不敏感型材料上升速度高于低温敏感型材料。相关分析表明,低温胁迫下,烟叶相对电导率耐冷系数与叶绿素、净光合速率、SOD活性的耐冷系数呈极显著负相关,与可溶性蛋白、POD活性、PAL活性的耐冷系数呈显著负相关,与丙二醛、叶绿素a/b的耐冷系数呈显著正相关。主成分分...     

烟草NCED3 基因的克隆及其干旱胁迫表达分析

为揭示9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED) 在烟草生长发育过程中的功能,通过同源克隆方法获得烟草品种K326 类胡萝卜素降解关键基因NCED3 两个cDNA 全长序列。序列分析表明:K326 NCED3-1 和NCED3-2 基因分别包含一个1842bp 和1830bp 的开放读码框(ORF), 各编码613 个和609 个氨基酸。预测蛋白质分子量分别为68177.8 Da 和67754.2Da,理论等电点(pI) 各为7.66 和7.28。跨膜区预测、亲水性和信号肽分析表明很可能是定位于线粒体膜上的亲水性跨膜蛋白。二级结构预测模型显示此蛋白结构以β 折叠和无规则卷曲为主。蛋白三级结构预测分析表明NCED3-1 与NCED3-2 空间结构极为相似。PEG6000 胁迫分析表明,干旱胁迫可以诱导NCED3 基因表达以及内源ABA 的积累。且在处理12h 之前,NCED3 表达与ABA 累积速度均呈现升高趋势,之后逐渐降低。研究结果为解析NCED3 在烟草抗旱方面的功能提供一定的研究基础。      

四川雪茄烟叶在成熟与晾制和发酵过程中烟草特有亚硝胺的积累动态

为明确雪茄烟叶在成熟、晾制及发酵过程中烟草特有亚硝胺（TSNAs）的积累及变化规律,以德雪3号（茄衣）和什烟1号（茄芯）为试验材料,在烟叶成熟、晾制及发酵环节对两种烟叶的中部叶及上部叶取样,并测定烟叶中的TSNAs含量（质量分数）。结果表明,德雪3号在3个生产环节TSNAs的积累量分别为153.53~208.26、574.10~597.50和647.40~1 090.73 ng/g。什烟1号在3个生产环节TSNAs的积累量分别为305.63~526.81、1 700.45~2 494.93和1 529.60~2 373.37 ng/g。两种雪茄烟叶TSNAs各组分和TSNAs总量在不同阶段积累差异较小,均表现为烟叶成熟前积累较少,调制和发酵阶段积累较多。在晾制和发酵环节茄衣品种德雪3号TSNAs总量的积累比例分别为30.65%~42.73%和46.29%~58.23%,茄芯品种什烟1号TSNAs总量的积累比例分别为45.26%~48.22%和40.71%~45.87%。随着烟叶晾制和发酵过程的推进,烟叶TSNAs含量呈现逐渐增加的趋势。因此,晾制和发酵时期是雪茄烟叶TSNAs积累的重要时期,也是调控其积累的关键时期。