利用环介导等温扩增技术快速检测沙眼衣原体方法的建立

建立一种利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)快速检测沙眼衣原体的方法。针对沙眼衣原体gyr A基因设计LAMP特异引物,并加入一条环引物LB提高反应效率,对反应的特异性、灵敏度和重复性进行评价,同时用沙眼衣原体阳性的临床样本进行LAMP检测验证。实时荧光LAMP结果表明,建立的LAMP方法特异性好,不与10种常见的病原微生物以及生殖道感染相关细菌发生非特异反应,灵敏度可以达到4.13×101 copies/μL;20次重复试验的Cq值变异系数为7.23%,反应稳定性良好;用LAMP方法对6份临床阳性样本进行检测,阳性符合率为100%。因此,该研究建立的沙眼衣原体LAMP检测方法快速、灵敏、稳定性好,能为感染筛查和早期诊断提供参考。     

LAMP实时浊度法快速检测大肠杆菌方法的建立与优化研究

根据大肠杆菌的特异性基因（malB）,设计与筛查环介导等温扩增（LAMP）的引物,通过对甜菜碱用量、环引物的浓度、反应温度、dNTPs用量等反应条件的优化,得到较佳的LAMP反应体系,建立了LAMP实时浊度法快速检测大肠杆菌;在较优条件下,先后对9株非大肠杆菌菌株进行特异性检测和5株大肠杆菌的进行同源性检测。此外,结合课题组自行研制的多通道浊度仪,对LAMP扩增产物进行实时浊度监测。结果表明：LAMP实时浊度法检测大肠杆菌的灵敏度达16.010 ng/L,与实时荧光定量PCR的检测限相当。因此,建立与优化LAMP实时浊度法可为食品中大肠杆菌的现场快速检测提供了有力手段。     

微流控LAMP芯片构建及在MRSA快速检测中的应用研究

构建一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),集细菌在线裂解、核酸提取、目标基因扩增和产物检测一体化的用于病原菌快速检测的集成式微流控芯片。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus,MRSA)为模式菌,以mec A为靶基因,在优化条件下用芯片实现对病原菌的在线检测,完成对101~106cfu MRSA的在线裂解、LAMP扩增和产物测定,采用荧光原位检测可得101~105cfu的检测范围和101cfu的检出限。该微流控LAMP芯片结构简单,操作便捷,可在1 h内实现对MRSA mec A基因的快速检测,具有较高的灵敏度和特异性,为下一步临床生物样本病原菌快速检测微流控芯片系统的构建奠定前期研究基础。     

食品中志贺氏菌快速检测免疫磁分离样品前处理技术研究

采用Protein A磁珠与志贺氏菌混合血清制备抗志贺氏菌多靶标免疫磁珠，建立了25 mL志贺氏菌免疫磁分离体系，并通过测定代表性食品(牛奶、水果、面包)中志贺氏菌生长曲线，设计食品样品前处理可行性技术方案，与环介导等温扩增(LAMP)检测技术整合进行了食品中痕量志贺氏菌快速检测验证。结果显示：多靶标免疫磁珠能同时捕获福氏、宋内氏、鲍氏、痢疾氏等4种志贺氏菌，捕获效率为35%～94%,非特异性小于1%(金黄色葡萄球菌10%除外),1～2×10¹ CFU志贺氏菌在25 mL纯牛奶、25 g梨/面包+25 mL志贺氏菌增菌肉汤基础中，通过6 h培养+免疫磁分离的策略可获得10² CFU/mL以上的志贺氏菌，将志贺氏菌检测样品前处理时间由48 h缩短至8 h内，并能够满足后续检测技术检出限的需求，实现了食品中志贺氏菌的快速检测。     

金华火腿中金黄色葡萄球菌的聚合酶链式反应检测

建立了一种用于金华火腿中金黄色葡萄球菌的聚合酶链式反应(PCR)检测方法.针对金黄色葡萄球菌独有的肠毒素基因(sea)设计了一对特异引物,在PCR体系中对相应片断进行扩增,扩增产物通过电泳技术与阳性对照进行对比来判断阴阳性.结果表明,该方法检出率高,样品中模板DNA含量仅有0.05 pg即可检出金黄色葡萄球菌,24 h即可报告结果.因此,PCR方法可以作为一种高效、敏感、特异性高的检测技术,用于金华火腿中金黄色葡萄球菌的快速检测.     

基于双富集微流控技术的食品中蜡样芽孢杆菌快速检测

为实现食源性致病菌多场景即时检验,替换常规检验及快检技术中耗时的增菌培养过程,以缩短检验时间和降低实验环境及设备要求。研究以蜡样芽孢杆菌为研究对象,采用双层膜富集样品中菌体,磁珠提取纯化微量DNA的方式,取代增菌培养过程,同时将环介导等温扩增反应与微流控芯片相结合,有效避免扩增中气溶胶污染问题。实验结果显示：使用双富集微流控技术检测食品中蜡样芽孢杆菌,可将现行国标的检验时间由5～7 d缩短至1 h内,方法特异性良好,检出限为10 CFU/g(mL)等同于现行国标,Ct值变异系数<5%,显示重复性好。研究建立的双富集微流控技术快速检测食品中蜡样芽孢杆菌方法可实现食源性致病菌即时快速检验,为食源性致病菌引起的食品安全事件和舆情风险防控快速反应提供技术支撑。     

SYBR Green I实时PCR检测转Cry1Ab/c基因水稻

为了建立转基因产品新型检测技术,采用SYBR Green I实时PcR技术和三对特异引物,检测抗虫转基因水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/e).结果表明,利用SYBR Green I染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到转Cry1Ab/c基因抗虫水稻外源基因(CaMV35S,NOS,CrylAb/c)扩增所产生的荧光信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体.SYBR Green I实时PCR技术是转基因成分检测的一种新方法.     

肠炎沙门氏菌种特异性FQ-PCR快速检测方法的建立

根据肠炎沙门氏茵(SE)种特异性DNA序列,设计合成了一对能特异性扩增130bp片段的引物和TaqMan探针,首次建立了SE的种特异性荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)诊断方法.该法在SE DNA含量为9×10 8～9×10 4拷贝有较好的线性关系;检测SE DNA模板的灵敏度为4拷贝/μL,检测SE细菌数的灵敏度为6 CFU/mL;特异性试验表明只对SE基因组呈阳性反应.分别应用该技术和传统细菌分离法检测60份来自人工感染鸭、小白鼠和肉兔的心、肝、脑和直肠粪便,结果显示两种方法对心、肝、直肠粪便的阳性检测结果符合率为100%,而FQ-PCR对脑的阳性检测率极显著(P＜0.01)高于细菌分离.研究结果表明,该方法快速、灵敏、特异、重复性好且能实时定量检测,可用于SE分离鉴定、SE感染疑似病例检测、SE体内动态分布规律研究及其分子流行病学调查.     

单增李斯特菌恒温荧光PCR检测方法的建立及应用

以单增李斯特菌的clf A基因为靶序列,针对该序列保守区,设计引物和探针,建立单增李斯特菌荧光PRA检测方法,研制单增李斯特菌荧光PCR快速检测试剂盒,并对其特异性、灵敏性、稳定性进行分析。结果表明该恒温荧光PCR方法及快速检测试剂盒特异性好、稳定性好、具有较高的灵敏度,最低可检测到0.05 pg/μL,是快速检测食源性增李斯特菌的有效方法,对我国食源性增李斯特菌的检测具有重要应用和推广价值。     

犬细小病毒Proofman-LMTIA检测方法

为评价Proofman探针的梯型熔解温度等温扩增技术（LMTIA）检测核酸的性能,以Proofman-LMTIA快速检测犬细小病毒为例,采用实时荧光定量PCR方法和微滴式数字PCR方法进行对比分析。针对犬细小病毒基因的特异性序列设计引物和Proofman探针,通过优化反应条件,对方法的特异性、灵敏度进行测试,再通过实时荧光定量PCR方法、微滴式数字PCR进行对比验证。结果表明,所建立的Proofman-LMTIA方法在最适反应温度为61℃时,与猫、犬等基因组DNA无交叉反应,灵敏度达到8拷贝/μL,且能够在20 min内完成检测,与实时荧光定量PCR和数字PCR方法结果具有一致性。该方法不仅在恒温条件下即可扩增,且具有快速、灵敏、高效等优点,适用于病毒的现场快速检测。