单核细胞增生李斯特氏菌LAMP试剂盒的研制及在食品检测中的应用

利用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立食品中单增李斯特氏菌的检测方法。通过对反应条件的优化,组装单增李斯特氏菌LAMP检测试剂盒,并对其特异性、敏感性和适用性进行验证。试验结果显示:该试剂盒适用于食品中单增李斯特氏菌的快速检测,用环介导等温扩增法在65℃条件下,1h内可检出单增李斯特氏菌,其灵敏度达17CFU/mL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。用该方法与国标方法分别检测120种样品中的单增李斯特氏菌,两种方法的符合率达100%。该试剂盒具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。     

改良LAMP检测鸡肉中单增李斯特氏菌的研究

本研究建立一种改良环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测鸡肉中单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L. monocytogenes)的方法。针对单增李斯特氏菌的溶血素基因(hlyA)设计LAMP引物,对单增李斯特氏菌进行特异性检测,通过荧光曲线和肉眼观察荧光颜色来判定检测结果。试验结果表明:改良LAMP方法检测单增李斯特氏菌具有良好的特异性,7株单增李斯特氏菌呈阳性结果,24株非单增李斯特氏菌呈阴性结果。与聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法相比,改良LAMP方法具有灵敏度高(5.4×100 fg/μL)、检出限低(3.9×100 CFU/g)的特点,均是PCR结果的100倍。对66份鸡肉样品进行检测,得到改良LAMP方法的敏感性为100%,特异性为98.41%,符合率为98.48%。综上所述,改良LAMP方法能够快速、准确的检测单增李斯特氏菌,具有很好的应用前景。     

单增李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立单增李斯特氏菌的快速检测方法.针对单增李斯特氏菌virR基因序列设计特异性引物及探针,建立等温扩增法,并利用免疫金标试纸条对结果进行检测.用10株单增李斯特氏菌、6株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌24株进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证.结果表明建立方法具有较好的特异性;增菌液检测灵敏度为102 cfu/test,DNA检测灵敏度为10°pg/test.建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高,适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测.     

实时荧光环介导等温扩增技术检测熏肉中单增李斯特氏菌的研究

建立一种实时荧光环介导等温扩增方法(Real-Time Fluorescence Loop-mediated Isothermal Amplification,RTF-LAMP)来快速、灵敏地检测熏肉中单增李斯特氏菌。针对单增李斯特氏菌的特异性基因inl B设计4条LAMP引物,并建立一套最优的RTF-LAMP反应体系。对该方法进行特异性验证,同时对灵敏度和人工污染熏肉的检出限进行测定。3株单增李斯特氏菌被检测为阳性,17株非单增李斯特氏菌为阴性。表明引物具有良好的特异性。RTF-LAMP和传统LAMP检测单增李斯特氏菌的灵敏度分别为1.1×10~1、1.1×10~2 CFU/m L。通过对熏肉进行人工污染,得出RTF-LAMP的检出限为3.5×10~1 CFU/g。通过与国标方法GB 4789.30—2016进行对比并计算RTF-LAMP反应的敏感性,特异性和准确度,结果分别为100.00%、98.44%和98.46%。研究建立的RTF-LAMP能够实时、快速地检测熏肉中单增李斯特氏菌,具有良好的应用前景。     

建立DARQ-LAMP方法快速检测单增李斯特菌

该研究针对单增李斯特氏菌的特异性基因hlyA设计引物,优化反应条件,建立实时荧光环介导等温扩增（realtime loop-mediated isothermal amplification,real-time LAMP）的检测方法,在此基础上,建立检测单增李斯特氏菌的基于淬灭基团释放环介导等温扩增检测方法（detection of amplification by release of quenching-LAMP,DARQ-LAMP）,分析其特异性和灵敏度。结果表明,该方法的适宜反应条件为反应温度63℃、Bst DNA 3.0聚合酶0.32 U/μL、淬灭探针双链（quenching probe double chain,QPD）探针浓度10%、Mg2+浓度6 mmol/L;对单增李斯特菌的检测限为7.3×101copies/mL,灵敏度是普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的100倍。该方法效率高、特异性好、灵敏度高,为环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究提供参考。     

单增李斯特菌RT-LAMP快速检测方法的建立

建立一种可快速检测单增李斯特菌的反转录-环介导等温扩增方法。针对单增李斯特菌的李氏溶血素基因(hly)设计多组引物,经引物筛选和配比优化,建立检测单增李斯特菌的实时荧光RT-LAMP方法,并通过菌株特异性、灵敏度和人工污染脱脂乳样品中的检出限对该方法进行评价。该方法特异性良好, 26株菌株中仅三株单增李斯特菌检出阳性;检测灵敏度高,对单增李斯特菌的菌悬液灵敏度为10~1 CFU/mL,是RT-qPCR方法检测灵敏度的10倍。人工污染样品直接检测的检出限为10~3 CFU/mL,而对样品增菌16 h后,单增李斯特菌的检出限提高到10~0 CFU/25 mL。所建立的RT-LAMP方法可以快速、准确地检测单增李斯特菌,操作简便,适合应急和现场监测使用。     

环介导等温扩增法检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌

目的采用环介导等温扩增技术检测动植物源性单核细胞增生李斯特氏菌。方法在北京市范围内各业态餐厅购买600份凉菜样品为研究对象,以单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因为目标基因,设计4条特异性引物,使用环比等温扩增法(loop-to-isothermal amplification, LAMP)创建凉菜中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法并将其应用于鉴定凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌。结果通过细菌分离培养法对600份凉菜进行检测,一共检测分离出37株致病菌菌株,其中包括7株单核细胞增生李斯特氏菌、10株沙门氏菌和20株大肠埃希氏菌,单核细胞增生李斯特氏菌的检出率为1.2%。用LAMP对样品中的菌株进行测定,7株凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌为阳性,其他菌株为阴性。通过LAMP方法检测动植物源性凉菜中分离的单核细胞增生李斯特氏菌平均检出限为2.2*10 CFU/μL、特异性为100%。动物源性凉菜中的致病菌含量较高。结论环介导等温扩增法具备灵敏、快速、操作简便的特点,适合用于餐饮行业的现场快速检测领域。     

环介导等温扩增技术快速检测奶粉中的单增李斯特菌

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下特异、灵敏、快速的新型基因扩增技术。试验以单增李斯特菌为研究对象,根据其特有的hlyA基因设计了一套特异性引物,进行LAMP扩增。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的灵敏度为2.45×101cfu/mL,其对人工感染奶粉样品的检出限为7.32×101cfu/mL。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带,特异性强。表明LAMP法适合于食品中污染单增李斯特菌的快速检测。     

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。     

七类食品单核细胞增生性增李斯特菌污染状况调查

利用李斯特显色培养基对食品中单增李斯特菌进行分离纯化后,提取基因组DNA,用PCR技术扩增hlyA基因特异性350bp的片段和iap基因特异性1500bp的片段,用此方法对七类食品进行检测。结果表明,冬春夏三季采集的62、60、62份样品中,分别检出单增李斯特菌3株、3株、10株,污染率分别为4.84%、5%、16.13%。夏季单增李斯特菌的污染情况比冬季和春季严重,其中蔬菜和牛奶中未检出单增李斯特菌;PCR检测可用于单增李斯特菌快速、特异、敏感检测。