基于PAMAM树枝状大分子纳米免疫传感器快速检验婴幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌

以聚酰胺胺树状大分子材料结合还原性石墨烯纳米复合物为电活性修饰膜层,固定于玻碳电极表面,采用物理吸附法固定化辣根过氧化物酶标记阪崎肠杆菌抗体制备成纳米免疫传感器,建立一种快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的方法。优化的试验条件:以K3[Fe(CN)_6]为探针,过氧化氢浓度为0.5 mmol/L,pH 7.0的PBS溶液为检测底液,孵育温度37℃、孵育时间20 min。采用微分脉冲伏安法研究免疫传感器响应电流与阪崎肠杆菌浓度之间的关系。结果表明,免疫响应电流与阪崎肠杆菌浓度之间呈线性关系(ΔIpc(μA)=-1.1817 lg C+1.723,R~2=0.9989),其检出限为5.8×10~1 CFU/mL(S/N=3)。该法用于检测婴幼儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌,其结果与国标方法(实时荧光PCR法)的数据一致,而且具有样品预处理简单、灵敏度高、快速、费用低等优点,可用于婴幼儿食品中阪崎肠杆菌的快速检测。     

免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法建立

目的:制备高效且特异性好的阪崎克罗诺杆菌抗体及其免疫磁珠,建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)检测奶粉中的阪崎克罗诺杆菌的方法。方法:制备阪崎克罗诺杆菌混菌抗体及其免疫磁珠,对免疫磁珠分别在纯培养及奶粉基质中的捕获率进行研究,利用MALDI-TOF MS对不同奶粉基质中不同杂菌污染条件下的检测样本进行鉴定并验证免疫磁珠的特异性。结果:阪崎克罗诺杆菌免疫磁珠在纯培养条件及奶粉基质中对4株阪崎克罗诺杆菌及其混菌的捕获率均>80%,联合MALDI-TOF MS鉴定结果显示在奶粉基质中不同杂菌污染条件下具有较好的鉴定结果,即使在高比例（1:100）杂菌污染条件下,仍能准确鉴定奶粉中阪崎克罗诺杆菌,此时检测样品中阪崎克罗诺杆菌浓度仅为20 CFU/mL。结论:本研究建立了一种操作简便、鉴定结果准确的免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法,为奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速准确鉴定提供了新的方法参考。     

基于多壁碳纳米管/SDBS/硫堇阪崎肠杆菌免疫传感器的研究

目的:研制一种灵敏度高、电化学性能稳定的免疫传感器,构建准确检测阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii,E.sakazakii)的电化学方法。方法:将硫堇(Thi)、辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体(HRP-anti-E.sakazakii)依次自组装固定于多壁碳纳米管(MWCNT)/十二烷基苯磺酸钠(SDBS)修饰的四通道丝网印刷电极上,制得一次性免疫传感器。采用原子力显微镜(AFM)表征电极修饰和孵育抗原后的表面形态,用循环伏安法(CV)考察不同修饰电极的电化学特性,根据还原峰电流的变化对阪崎肠杆菌进行测定。结果:在优化的实验条件下,该方法检测阪崎肠杆菌的线性范围为102～108cfu/mL,检测限为5.7×101cfu/mL(S/N=3)。结论:该免疫传感器灵敏度很高,具有较好的特异性、重现性(RSD=6.3%)、稳定性(4℃无菌容器中放置15d后电流响应为初始值的93.24%)和准确性(与GB/T4789.40-2010符合率为96.67%),具有一定的应用潜力。     

基于电沉积石墨烯阪崎肠杆菌免疫传感器研究

为研制一种新型免疫传感器并用于快速检测阪崎肠杆菌(E.sakazakii),采用自组装方法将辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体(HRP-anti-E.sakazakii)固定于修饰有电沉积石墨烯(ERGO)的丝网印刷碳电极上,制得一次性酶免疫传感器。采用循环伏安法(CV)考察不同修饰电极的电化学特性,根据CV还原峰电流值的变化对E.sakazakii进行快速检测。在优化的检测条件下,该方法检测E.sakazakii的线性范围为102～109cfu/mL,检测限为9.1×101cfu/mL(S/N=3)。该酶免疫传感器灵敏度高,并具有良好的特异性、重现性(RSD=6.4%)、稳定性(4℃无菌容器中放置15d后电流响应为初始值的90.05%),具有一定潜在应用价值。     

环介导等温扩增法快速检测阪崎肠杆菌

目的：研究阪崎肠杆菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)方法,实现对食品中阪崎肠杆菌的快速检测。方法：针对阪崎肠杆菌16S rRNA 基因(16S rDNA)及外膜蛋白A(OmpA)基因设计LAMP 引物,扩增后通过电泳或加入显色剂SYBR-GREEN Ⅰ检测。结果：LAMP 法能有效特异地检测出阪崎肠杆菌;以16S rRNA 引物检测阪崎肠杆菌的最低检出限为32CFU/mL,用OmpA 引物检测阪崎肠杆菌的最低检出限达3CFU/mL,扩增产物加入SYBR-GREEN Ⅰ在紫外条件下可见荧光,与电泳检测具有同样的灵敏度。结论：LAMP 法可实现对阪崎肠杆菌的快速检测,在食品检测中具有广阔的应用前景。     

乳中阪崎克罗诺杆菌的快速捕获方法的建立

利用免疫磁捕获技术,建立了高效、快速的乳中阪崎克罗诺杆菌的捕获方法。将阪崎克罗诺杆菌抗体与Fe_3O_4磁珠偶联,制备特异性免疫磁珠并快速富集乳中的阪崎克罗诺杆菌。结果表明:此方法特异性强,且针对纯培养物中阪崎克罗诺杆菌的检测灵敏度达到104~10~5m L~(-1),乳中阪崎克罗诺杆菌的灵敏度达到10_5~10~6m L~(-1)。该方法能够大大缩短阪崎克罗诺杆菌的增菌时间,辅以适宜的检测方法即可实现对乳中阪崎克罗诺杆菌的快速富集,并且具有更高的特异性。     

乳粉中阪崎肠杆菌检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检测乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的速度和准确性。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》和经优化的SN/T1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法》以及能力验证作业指导书对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)进行检测和结果判断。结果通过实时荧光PCR法的快速初筛,初步判断样品CODE29为阴性,样品CODE95为阳性;再经显色平板分离和VITEK2生化鉴定,结果显示:样品CODE29检出肺炎克雷伯杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌;样品CODE95检出阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌。结论本次乳粉样品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果合格,为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。     

一种快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法

对磁珠吸附过程中三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA,TE)缓冲液的p H值、蛋白酶K添加量、吸附时间和吸附温度等参数进行了优化。在优化条件下氨基磁珠可以非特异性地直接吸附婴幼儿配方奶粉中存在的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),并结合聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术特异性扩增阪崎克罗诺杆菌DNA,检测灵敏度达到102CFU/mL。此外,经特异性试验验证,此方法用于检测常见食源性致病菌及克罗诺菌属中的非阪崎克罗诺杆菌均无交叉反应。同时,经干扰性试验验证,体系中存在的其他干扰菌株DNA并不会影响阪崎克罗诺杆菌的检测。该方法避免了抗体的使用,解决了抗体制备难度大、成本高等问题,同时克服了传统方法 3～5 d前增菌时间过长的弊端,实现了对婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测。     

乳粉中阪崎肠杆菌污染检测试剂盒的研制

目的：以乳粉中污染的阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）为检测目标,开发一种能快速检测其污染的试剂盒。方法：以两株阪崎肠杆菌单克隆抗体分别为包被抗体和检测抗体,建立双抗体夹心酶联免疫吸附实验方法,优化各个反应条件,制成在2 h内能发生显色反应的检测试剂盒。结果：包被抗体的最佳工作质量浓度为10 μg/mL,检测抗体的最佳稀释倍数为1∶5 000。试剂盒的检测限为104 CFU/mL,在104～108 CFU/mL范围内OD450 nm值与阪崎肠杆菌浓度的常用对数值呈线性关系。特异性实验中,试剂盒可检出3 株阪崎肠杆菌标准菌株,对其他9 株食品中常见致病菌的检测均呈阴性。模拟带菌实验中,初始菌浓度为1 CFU/mL的模拟样品经过8 h前增菌后,通过该试剂盒便可检出。该试剂盒的批内、批间变异系数均小于6%,至少可在室温保存6 个月。结论：该双抗体夹心试剂盒具有灵敏度高、特异性好、精密度高、稳定性强等优点,可应用于乳粉中阪崎肠杆菌的快速检测。     

百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用

为探究百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用及可能的抑制机理,检测了百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的最 小抑菌浓度（minimal inhibitory concentrations,MIC）及对其生长动力学模型的影响,并测定百里醌处理后阪崎肠 杆菌胞内ATP浓度、胞内pH值、膜电位、细胞膜完整性的变化,最后利用场发射扫描电子显微镜观察细胞形态的 改变。结果表明：百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的MIC为0.3～0.6 mg/mL;百里醌使阪崎克罗诺肠杆菌的生长迟滞期 延长,最大生长速率减小;百里醌影响了阪崎克罗诺肠杆菌细胞膜的通透性,表现为：质量浓度为MIC和2×MIC 的百里醌使细胞内ATP浓度由6.52 μmol/L分别降低为0.27 μmol/L和0.17 μmol/L,胞内pH值分别由5.69降低为5.22和 4.99,细胞膜完整菌体比例分别降低至80%和22%,引起细胞膜膜电位超极化;场发射扫描电子显微镜观测表明百 里醌使阪崎克罗诺肠杆菌细胞膜褶皱,菌体干瘪。综上所述,百里醌是通过影响细胞膜通透性和改变细胞形态抑制 阪崎克罗诺肠杆菌。这些结果表明百里醌有潜力作为控制阪崎克罗诺肠杆菌的天然抑菌剂应用于食品中。