人源细胞色素P450 2E1与细胞色素P450氧化还原酶的共表达

目的利用大肠埃希菌(E.coli)表达系统异源表达细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1),并与细胞色素P450氧化还原酶(cytochrome P450 oxidoreductase,POR)实现共表达,使其具有代谢活性,为药物代谢的研究提供单一性的酶源。方法以人肝组织RNA为模板,RT-PCR扩增CYP2E1基因,插入pCW空载体,构建重组表达质粒pCW-2E1,转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定;利用双启动子原理构建CYP2E1与POR共表达的重组质粒pCW-2E1-POR,采用对氨基苯酚法检测CYP2E1重组酶的代谢活性,并对不同培养时间(18、28、38 h)的代谢活性进行比较。结果质粒pCW-2E1经PCR鉴定,证明构建正确;表达的重组人CYP2E1蛋白相对分子质量约56 000,主要以可溶性形式表达。质粒pCW-2E1-POR经PCR及酶切鉴定,证明构建正确;导入质粒pCW-2E1-POR的重组菌提取的蛋白样品具有明显的代谢活性,培养18、28、38 h后,代谢活性均值分别为(0.195±0.004)、(0.189±0.003)和(0.192±0.004)nmol/(min·mg),差异无统计学意义(P0.05),但与导入质粒pCW-2E1的重组菌提取的蛋白样品的代谢活性相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论成功构建了具有代谢活性的CYP2E1重组酶,且3个培养时间段之间的代谢活性无明显差异。     

金属蛋白的配位化学：细胞色素P450研究进展

介绍了细胞色素P_(450)的研究进展。     

细胞色素P450酶系对除草剂代谢作用的研究进展

细胞色素P450酶系是广泛存在于动物、植物和微生物体内的一类具有混合功能的血红素氧化酶系。在高等植物中执行着各种不同功能．包括植物正常生长发育所必需的初级代谢物和次级代谢物的生物合成，而且参与许多外源性物质包括除草剂等的生物氧化。笔者综述了与除草剂代谢有关的细菌、哺乳动物和植物细胞色素P450酶系，概述了细胞色素P450酶系代谢作用在除草剂选择性、耐受性、抗药性机理和抗除草剂作物品种培育方面的意义，以及转细胞色素P450基因风险性评价等。     

作物中引入耐除草剂细胞色素P450基因的应用

人们根据除草剂的作用部位和化学结构的不同予以分类。按不同的作用点,至少可把现有的除草剂分为13类。在全世界,已发现了84种不同作物对各类除草剂产生抗性(59种双子叶和25种单子叶植物),其包涵了大多数已知除草剂的作用点和化学类型。对除草剂的抗性机制,包括了在除草剂靶标点中除草剂的结构变化、代谢解毒和在吸收中互生、易位或分隔作用。     

细胞色素P450蛋白结构对环境中致癌物响应的分子模拟

细胞色素P450作为生物标记物,在环境质量监测中具有重要应用。采用同源建模和分子动力学方法模拟了细胞色素P450在纯水体系和含致癌物氨基甲酸甲酯的污水体系中的响应情况,在分子水平上研究了细胞色素P450的蛋白结构在不同水环境中的变化。结果表明,相较于纯水体系,细胞色素P450的蛋白结构在污水体系中发生了明显变化,总表面积明显增大,二级结构盐桥、转向、折叠和螺旋所含残基数量发生了明显变化,氨基甲酸甲酯是影响细胞色素P450蛋白结构变化的主要因素;蛋白与水之间氢键数目的减少是细胞色素P450蛋白结构发生变化的主要原因;在污水体系中,细胞色素P450蛋白结构变化的主要区域是转向区域。该研究为新型标记物的设计以及细胞色素P450的应用提供了理论依据。     

细胞色素P450单加氧酶抑制剂中间体合成反应的研究

本文对细胞色素P450单加氧酶抑制剂中间体合成的反应进行研究。2-(3-((2-异丙基-4-噻唑基)-4-甲基)-3-甲基脲基)-环丁酸内酯与三氯化铝反应制得氯化物,得到的氯化物与过量吗啡啉反应。反应得到吗啡啉基转移的产物。氯化物在吗啡啉作用下,首先形成化合物5,进而发生吗啡啉转移得到化合物4。     

细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的半理性改造

为进一步改造细胞色素P450 BM-3酶对吲哚的羟基化能力,以P450 BM-3结构与功能关系的推测为指导,选择突变酶P450 BM-3 （A74G/F87V/L188Q/E435T）为父本,在可能影响P450 BM-3催化吲哚羟基化区域选择性的D168位点进行定点饱和突变,根据全细胞催化产物颜色及组成进行筛选,得到了产物组成、酶动力学性质与父本不同的两个突变酶。突变酶D168W的吲哚羟基化产物中90%是靛玉红,而另一个突变酶D168R的产物中87%是靛蓝,产物组成均不同于亲本。在催化吲哚羟基化时,D168W的k_cat与父本相当,但K_m却是父本的4.8倍,催化活力只有父本的20%;而D168R的k_cat是父本的1.9倍,K_m是父本的82%,催化活力比父本提高了1.37倍。结果表明,在E435T突变上叠加D168位氨基酸残基突变对酶的催化性质产生了单一位点突变所不具有的协同效应,对酶催化的区域选择性和催化活力都有显著影响,以致改变了催化产物组成。这种基于知识的半理性定向进化方法由于是在关键位点进行突变,因此突变目的性强、突变效果显著。     

葡萄柚中细胞色素P450酶抑制剂的研究进展

葡萄柚果汁中富含呋喃香豆素类化学成分,这些呋喃香豆素类化合物特别像6,7-DHB及其类似物能抑制药物代谢酶细胞色素P450,以致于提高特定药物口服生物利用率或阻碍致癌物质的活性。综述了近年来发现的呋喃香豆素化合物的类别、活性及合成方面的情况。     

细胞色素P—450在水稻和水莎草中的O—脱烷基化作用的不同活性

细胞色素P-450单氧化酶在所有的生物有机体中是重要的多蛋白质酶系统,其催化着内生的及异种有机基质的单氧化作用。在较高级植物中,植物微粒体细胞色素P-450构成了选择性除草剂的代谢和解毒作用的主要氧化途径,特别是,包括吡嘧磺隆在内的磺酰脲类除草剂的O-脱烷基化反应为影响选择性的主要因素,然而,在度管内,研究植物细胞色素P-450对除草剂代谢作用是很困难的,因为它比动物体中的细胞色素P-450水平低得多,另外,除草剂分子可能有比自然生成的基质细胞色素P450更少的基质,在试管内,这些阻碍常导致构成除草剂单氧化作用较低亦不易测得,有几种试验方法用来从植物体中获得较高微粒体细胞色素P-450活性,Weck-Reichhart等人最早报道了在植物体中细胞色素P-450的活性对乙氧基香豆素和乙氧基试卤灵的O-脱烷基化作用,这个敏感试验允许对细胞色素P-450的活性及其可能的诱导作用和抑制作用进行简单的测定,通常这些测定在试管内被用于预先处理的从发白植物组织中分离出来微粒体。     

新型电荷型纳米盘的可控制备及其与细胞色素P450的结合性能

分别采用氮气吹干法和旋转蒸发法制备由磷脂和膜支架蛋白组成的电荷型纳米盘,用凝胶过滤色谱对其尺寸分级,分析了其性能,考察了其与肝微粒体细胞色素P450的结合能力。结果表明,纳米盘外观澄清透明,微观呈圆盘状,平均直径10 nm,在pH 7.4下Zeta电位为?19.86 mV;肝微粒体破碎液与纳米盘能很好结合,CO差示光谱在450 nm出现明显吸收峰,细胞色素P450含量为0.10 nmol/mg,比活比未经纳米盘处理时提高13.0倍,较传统方法提升1.5倍,且操作时间由数日缩短至数小时。电荷型纳米盘在结合膜蛋白细胞色素P450的同时,活性保持良好,在膜蛋白研究领域极具应用潜力。     

定点突变提高细胞色素P450 BM-3吲哚羟基化能力

为进一步提高细胞色素P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)对吲哚的羟基化能力,根据酶结构与功能的关系,以突变酶E435T为基础,在168位点引入D168L突变,获得了吲哚羟基化能力得到显著提高的突变酶D168L/E435T。突变酶对吲哚的K_m为1.72 mmol·L^-1(父本2.09 mmol·L^-1),转化数(k_cat)为28.15 min^-1(父本4.04 min^-1),表明D168L定点突变可以略微提高酶对底物的亲和力,但主要的效应是促进了底物的转化速率,这两个效应的综合表现是使酶的催化效率(k_cat K_m^-1)比父本酶提高了8.48倍。此外,产物中副产物靛玉红的比例也降低为1.2%(父本7.3%),这说明该突变酶催化吲哚的区域选择性上也更有利于靛蓝的生成。     

氨基酸突变对细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的影响

利用饱和定点突变技术对细胞色素P450 BM-3（A74G/F87V/L188Q）（PT）的168和435氨基酸位点分别进行随机突变,根据其羟基化吲哚生成的靛蓝在670nm处具有特殊吸收峰进行高通量筛选,获得了三个高于亲本酶（PT）的突变酶D168H、D168L和E435T。通过考察突变酶反应动力学参数、电子耦合率、热稳定性、最适pH以及区域专一性的变化情况,发现相对亲本酶而言所有的突变酶对底物吲哚的亲和力和催化效率都得到了不同程度的提高,其中突变酶D168H的kcat值比亲本酶提高了3倍多;突变酶D168H的电子耦合率比亲本酶大约降低了2倍,而突变酶D168L和E435T的电子耦合率却有轻微的提高;所有突变酶均在pH8.2附近表现出最大羟基化吲哚生产靛蓝的能力;突变酶D168H对吲哚的区域选择性得到了提高,主产物靛蓝从亲本酶的72%提高到了93%。另外,热稳定性实验表明：尽管突变酶D168H和D168L的热稳定性较亲本酶有所降低,但活力的大幅度提高并未对酶的热稳定性造成大的伤害。以上所有的结果为了解细胞色素P450 BM-3结构与功能关系提供了有用的信息,同时为进一步定向进化P450BM-3提高其功能特性提供了进化模板。     

黑龙江省寒地高血压患者细胞色素P450 CYP3A5基因多态特征性分析

目的:分析黑龙江省寒地原发性高血压患者CYP3A5基因分布频率,研究该地区CYP3A5基因特征性,为个体化精准治疗高血压病提供临床依据.方法:应用原位杂交荧光染色技术检测入组的高血压患者及健康者CYP3A5基因型,根据基因型分组对比基因型频率及等位基因分布频率,与已报道的我国其他非高寒地区、不同民族进行比较,探讨黑龙江...     

HPLC法同时检测大鼠血浆中3种细胞色素P450探针药物

目的:建立同时检测大鼠血浆中3种细胞色素P450(CYP450)探针药物,即氯唑沙宗(CYP2E1)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)和咪达唑仑(CYP3A4)的高效液相色谱方法.方法:色谱条件选用Topsil TM C18 column(250mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇-(NH4)2HPO4(54∶46,pH...     

生物样品中7种CYP450酶底物分析方法的建立与验证

本实验基于Cocktail方法和UPLC-MS/MS技术,对大鼠血浆中七种探针药物——非那西丁、安非他酮、阿莫地喹、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬、咪达唑仑进行检测与方法学考证。方法学考察结果表明,该方法专属性好,不受空白血浆及内标干扰,线性范围内R2≥0.996,定量下限RSD≤12%,仪器精密度与样品准确度RSD≤15%,基质效应在95%～105%范围。因此,该方法准确、稳定、可靠,可用于后续研究的样本分析,为临床药物-药物相互作用研究提供检测方法。     

香豆素醚的O—胶烷基化作用对诱导剂、抑制剂和磺酰脲对水稻细胞色素P—450的作用

通过对7－乙氧基香豆素O－脱乙基酶（ECOD）和7－甲氧基香豆素－脱甲基酶（MCOD）在水稻靶标微粒体中活性的测定,获得了磺酰脲类除草剂对水稻中O－脱烷基化作用的选择性和安全作用的基本数据。通过测定烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸细胞色素P－450（c)还原酶（HADPH cyt.c.red),证实了电子转移系统对细胞色素P－450反应的影响。安全剂：核酸（NA）和乙醇;抑制剂：1－氨基苯并三唑（1－ABT）和增效醚（PBC）;除草剂：哌草丹、1－（α,α二甲基苄基）－3（p-甲苯基）脲、吡嘧黄隆（PSE）和苄嘧黄隆（BSM）的使用,控制了细胞色素P－450相关的反应。经过安全剂（NA、乙醇）和除草剂（哌草丹、1－（α,α二甲基苄基）－3－（p-甲苯基）脲、PSE、BSM）的处理,诱导了O－脱烷基化作用,因此,可通过使用磺酰脲类除草剂（PSE、BSM）和诱导细胞色素P－450酶的抑制剂（1－ABT、PBO）来调节抑制的程度。相对而言,NADPH细胞色素阴极还原酶并没有因受到诱导或抑制作用而发生明显变化,这些结果表明：细胞色素P－450与PSE和BSM磺酰脲类除草剂的氧化代谢机理有关。这些除草剂可以是一个基质或微粒体氧化酶的竞争抑制剂。     

响应面法优化工程菌产细胞色素P450 BM-3的发酵条件

采用快速有效的数学统计方法对工程菌产细胞色素P450 BM-3的发酵条件进行了优化.首先利用Plackett-Burman设计从众多影响产P450 BM-3的因素中筛选出影响较大的4个因素：FeCl₃含量、诱导时机、诱导时间和接种量.在此基础上再利用响应面法中的杂合设计进行优化,通过拟合得到响应曲面函数,获得了最佳的实验条件.在该实验条件下,P450 BM-3酶活从37.6×10^-3U•ml^-1提高到57.9×10^-3U•ml^-1.