HIV-1C亚型调控蛋白Nef在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型调控蛋白Nef,为研制HIV疫苗寻找新的途径。方法通过PCR扩增,获得HIV-1C亚型Nef基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。结果表达产物是相对分子质量为50000的GST融合蛋白,且能与p27单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Nef蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达。     

重组HIV-1 DNA疫苗工程菌中试发酵工艺的优化

目的优化重组HIV-1DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法优化质粒转化条件,制备工程菌Jm109/pVAX1-MEGp24种子液,连续传30代,检测其遗传稳定性;优化培养基成分、补料基质、补料方式和培养时间,确定最佳发酵参数;并应用最佳发酵参数,于50L发酵罐进行3批中试规模的发酵,考察在发酵培养过程中质粒的稳定性和超螺旋质粒的比例。结果工程菌在连续传代30次后,质粒拷贝数基本保持稳定;最佳发酵参数为:采用以甘油为碳源的培养基,以梯度恒速流加方式补料,培养时间13h;通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌67.0～68.6g/L,质粒含量可达1.62～1.73mg/g菌,超螺旋质粒的比例达93%以上。结论已建立了稳定的重组HIV-1DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

利用中国流行株HIV-1 Gag重组痘苗病毒与核酸疫苗免疫的新程序

目的 将中国流行株ＨＩＶ－１　Ｇａｇ基因在痘苗病毒中表达,以重组痘苗病毒与核酸疫苗混合免疫,进 而研制艾滋病疫苗。方法 将中国流行株ＨＩＶ－１ Ｇａｇ基因片段插入到ｐＪ３８载体启动子下游,经同源重组和血凝素 阴性空斑筛选重组痘苗病毒,经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ检测目的蛋白。以重组痘苗病毒与核酸疫苗进行小鼠免 疫试验,淋巴细胞转化实验,ＣＩＬ,ＣＤ＋４;ＣＤ＋８细胞计数及细胞免疫和体液免疫水平检测。结果 重组痘苗病毒ｖＪ３８ Ｇａｇ具有良好的免疫原性,与２ｒＶＶ－ＤＮＡ混合免疫效果更好。结论 重组痘苗病毒 ｖＪ３８ Ｇａｇ能够表达Ｇａｇ蛋白并诱 导机体产生细胞免疫和体液免疫。     

HIV-1表面糖蛋白gp120 DNA疫苗质粒的构建与表达

目的 构建含HIV-1表面糖蛋白基因的真核表达质粒,并在Hela细胞内表达。方法 在核酸疫苗载体质粒 pVAX1中插入gp120基因,构建真核表达质粒pVAXGP。在体外用脂质体法将重组质粒转染Hela细胞,并用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验和Dot-ELISA对表达产物进行检测。结果 间接免疫荧光试验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹试验和Dot-ELISA结果均显示,重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gp120蛋白。结论 已成功地构建了真核表达质粒,且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。     

中国流行株HIV-1Gag蛋白在重组鸡痘病毒的表达及鉴定

目的 以鸡痘病毒为载体,表达ＨＩＶ－１　Ｇａｇ蛋白,进而研制ＡＩＤＳ疫苗。方法 以鸡痘病毒２８２Ｅ４株 非必需区ＴＫ基因为侧翼,插入ＶＶ突变型Ｐ７．５串联启动子和牛痘病毒Ａ包涵体晚期启动子与２０个串联的突变型 早期痘苗病毒Ｐ７．５启动子组成复合启动子及ＬａｃＺ报告基因构建重组表达质粒ｐＵＴＡＬ。在ＡＴ１－Ｐ７．５复合启动子 下游,插入编码中国流行株 ＨＩＶ－１　Ｇａｇ基因（Ｂ亚型）,构建了重组表达质粒ｐＵＴＡＬ－Ｇａｇ。重组质粒Ｇａｇ与ＦＰＶ共 转染ＣＥＦ细胞,进行同源重组。通过ＢＵｄＲ加压筛选,Ｘ－ｇａｌ染色,获得重组鸡痘病毒ｖＵＴＡＬＧ,用于感染ＢＨＫ细胞 并免疫小鼠。结果　经Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测,重组病毒表达了Ｇａｇ蛋白相对分子质量分别为５５０００、４８０００、２４０００和 １７０００,为Ｇａｇ蛋白的Ｐ５５、Ｐ４８、Ｐ２４和Ｐ１７蛋白。重组病毒免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。结论　所重组的病毒 成功地表达了目的蛋白并进行了正确加工。     

基因重组HIV-1 P24抗原的应用分析

目的 分析重组HIV-1-p24抗原,以便研制HIV-抗体诊断试剂。方法 以纯化重组P24为包被抗原,应用ELISA检测HIV-Ab国家参比品和正常人血清。结果20份阳性HIV-Ab检出阳性19份,符合率为95％;20份阴性HIV-Ab检出阴性18份,符合率为90％;50份正常人血清检测结果均为阴性。结论 所研制的重组P24抗原具有较高的特异性和敏感性,可用于制备HIV抗体诊断试剂。     

HIV-1Gag p24的高效表达

将编码人免疫缺陷病毒I型 (HIV 1)核心蛋白p2 4的基因序列克隆到原核表达载体pET2 8(b)中 ,并转化不同的受体菌后 ,用IPTG诱导表达。SDS PAGE分析表明 ,受体菌BL2 1(DE3)plysS表达量最高 ,表达的重组p2 4蛋白占菌体总蛋白的 46 %。目的蛋白可与抗HIV 1p2 4单克隆抗体发生特异性反应。     

HIV-1 HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Ta(tB41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础。方法在HIV-1HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tat1-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因ta(tB41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-ta(tB41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。融合蛋白经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Westernblot及ELISA鉴定。结果重叠延伸PCR扩增出约500bp的ta(tB41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-ta(tB41-101N)构建正确。SDS-PAGE分析显示,表达的Ta(tB41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36000,约占菌体总蛋白的7%,纯化后纯度约为60%;Westernblot和ELISA分析显示,Ta(tB41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应。结论已成功构建了HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础。     

表达HIV-1 gp160膜蛋白靶细胞的制备及鉴定

目的获得表达INV-1 gp160膜蛋白的靶细胞,用于HIV-1特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)和抗HIV-1重组毒素细胞杀伤活性检测。方法采用PCR方法,从质粒pJen 10中扩增HIV-1 gp160基因,插入pGEM-T载体,测序后克隆入pIRESl neo载体中构建成重组质粒pIRE160,酶切鉴定正确后,转染人肝癌细胞(SMMG-7721),CA18加压筛选至细胞不再死亡为止,并采用Western blot和间接免疫荧光法对制备的靶细胞进行检测。结果HIV-1 gp160在SMMC7721表面表达,并裂解为gp120和gp41蛋白。结论已成功得到稳定表达HIV-1 gp160的靶细胞,且表达的蛋白具有良好的特异性。     

治疗性HIV-1重组DNA疫苗的构建与免疫效果评价

目的　构建编码HIV- 1多表位抗原基因 (MEG)与p2 4基因嵌合的核酸疫苗 ,并评价其免疫效果。方法　将编码HIV -1多表位抗原基因 (MEG)与p2 4基因插入到真核表达载体pVAXI中 ,构建HIV- 1治疗性重组核酸疫苗质粒。通过ELISA试剂盒检测免疫恒河猴血清中HIV -1特异性抗体 ,并通过淋巴细胞转化实验检测HIV -1特异性T淋巴细胞增殖反应。结果　构建的重组核酸疫苗质粒pVAXI -MEGp2 4免疫恒河猴后 ,能有效地刺激产生T淋巴细胞特异性增殖反应 ,并诱导产生抗HIV -1特异性抗体。结论　所构建的重组核酸疫苗质粒能诱导机体产生免疫反应。     

重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体纯化条件的优化

目的优化重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件。方法将表达Gp41的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎、洗涤分离提取包涵体,以不同pH值的低浓度变性剂溶解包涵体,稀释复性并用离子交换层析纯化目的蛋白,纯化产物经West-ernblot进行鉴定。结果以50mmol/LTris buffer、2mol/L,pH11.5尿素溶解的包涵体蛋白得到很好的溶解,目的蛋白复性得率大于40%。经纯化后,目的蛋白的纯度大于90%,且具有良好的反应原性。结论优化了重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件,为HIV-1Gp41抗原纯化工艺的放大提供了依据。     

HIV-1 GP120主要抗原性片段的制备及其在HIV诊断中的应用

目的研制HIV中国流行株RL42GP120主要抗原性片段,以便进一步开发HIV抗体检测试剂。方法克隆RL42毒株GP120蛋白C-端250个氨基酸的编码序列,克隆入大肠杆菌表达载体pBV220进行表达。通过包涵体处理和离子交换层析纯化目的蛋白。将纯化后的蛋白用狭缝电转技术转印硝酸纤维素膜,利用HIV参考品血清检测其灵敏度和特异性。结果目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的10%左右。纯化后其纯度高于95%,HIV参考品血清检测显示出良好的灵敏度和特异性,检测8份阳性临床标本无一漏检,而7份阴性临床标本无交叉反应。结论已研制出具有良好灵敏度和特异性的HIV-1GP120主要抗原性片段。为开发HIV抗体检测试剂创造了条件。     

中国流行株HIV-1Gag与IFN-α2b重组质粒的构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 ＨＩＶ－ １Ｇａｇ与 ＩＦＮ－ α２ｂ共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以 核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ－ＩＦＮ,通过间接免疫荧光 试验、ＤｏｔＥＬＩＳＡ检测Ｃａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,进行淋巴细 胞转化试验、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测。 结果构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,诱导特异性 ＣＴＬ反应,当和 ＩＦＮ－α２ｂ共表达时免疫效果更加显著。结论与 Ｇａｇ蛋白共表达的 ＩＦＮ－ａ２ｂ能够进一步提高细胞 免疫与体液免疫水平,构建的重组质粒为ＨＩＶ－１ＤＮＡ疫苗的研究奠定了一定实验基础。     

HIV-1核酸血筛试剂国家参考品的研制

目的研制HIV-1RNA血筛试剂国家参考品。方法收集HIV-1病毒培养物、我国不同地区的HIV-1感染者血浆以及正常人样品,经HIV-1病毒载量试剂检测,对HIV-1RNA阳性的样品进行env基因型分析,从中筛选参考品的候选样品。结果共筛选8份HIV-1RNA阳性的样品作为阳性参考品,病毒载量均高于5000IU/ml;8份HIV、HBV、HCV均为阴性的血浆样品作为阴性参考品;以1份病毒培养样品作为灵敏度参考品的原始样品,经WHOHIV-1RNA标准品标定,其HIV-1病毒载量为3.79×104IU/ml;反复3次冻融对参考品的病毒载量无明显影响。结论已制备HIV-1RNA血筛试剂国家参考品,为我国HIV-1核酸血筛试剂的质量控制和标准化提供了依据。