我国生产用卡介菌的传代稳定性

目的研究我国生产用卡介菌上海株在传代过程中分子遗传学特性的稳定性。方法应用多重PCR法,对我国生产用卡介菌上海株工作种子批及其不同代次菌的各缺失区、插入序列IS6110及基因座SenX3-RenX3串联重复序列拷贝数进行检测。结果我国生产用卡介菌上海株的工作种子批及其第6、9、12代菌均缺失RD1、RD2,未缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDenmark/Glaxo;含有1个IS6110插入序列和3个SenX3-RenX3基因座串联重复序列。结论我国生产用卡介菌上海株在传12代以内,其分子遗传学特性是稳定的。     

卡介苗生产用菌株的遗传稳定性研究

目的观察我国生产用卡介苗上海D2PB302菌株(以下简称卡介苗上海D2株)的遗传稳定性。方法提取卡介苗上海D2株工作种子批4、7、10、13、15代单批培养物基因组DNA,以其为模板,PCR扩增16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因,并进行测序鉴定;对卡介苗上海D2株缺失区RD1、RD2、RD8、RD14、RD16及双组分系统操纵子SenX3-RegX3串联重复序列进行多重PCR检测;对卡介苗上海D2株缺失区RD1及Esat6基因进行多重PCR检测;并对基因座SenX3-RegX3进行序列分析。结果卡介苗上海D2株工作种子批4、7、10、13、15代单批培养物的16S rRNA序列均未发生变异,与GenBank中登录的Pasteur 1173P2株序列(AM408590.1)相似性为100%;卡介苗上海D2株工作种子批各代次特征性凝胶电泳图谱显示条带位置均相同,其基因座SenX3-RegX3有3个串联重复序列,每个串联重复序列均以ATG起始,TG结尾,且前后重叠连接在一起;卡介苗上海D2株工作种子批各代次中均缺少编码毒力的Esat6基因。结论卡介苗上海D2株与国际常用卡介菌亚株相比具有其特征性的遗传学特性,在传代15代次以内,分子遗传学特性稳定。在《中国药典》三部(2010版)规定的12代次内制备疫苗,卡介苗遗传特性一致。     

卡介菌不同代次制备的疫苗质量分析

目的分析由卡介菌上海D2株工作种子批连续传代至不同代次的菌种制备的疫苗的质量差异。方法选取自工作种子批(11-007)传代至6、9、12代的单批培养物制备的皮内注射用卡介苗,采用多重PCR法鉴定特异性缺失区RD1;对原液的单位产能、半成品的沉降率、成品的效力及热稳定性进行测定,并对结果进行统计学分析。结果6、9、12代菌种培养物制备的卡介苗成品缺失RD1区,具有卡介菌特征;各代次制备的疫苗单位产能、沉降率、动物效力、热稳定性检测结果差异均无统计学意义(P>0.05),且疫苗动物效力、热稳定性检测结果均符合《中国药典》三部(2010)版及国家药监局批准的企业注册标准。结论工作种子批连续传代至不同代次的卡介菌制备的皮内注射用卡介苗均缺失RD1区,具有卡介菌的特征,关键质量指标安全、有效、一致。     

国内外卡介菌亚株抗生素敏感特性分析

目的分析国内外不同卡介菌亚株的抗生素敏感特性。方法对国内外不同卡介菌亚株采用比例法进行一线抗结核药物[异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RFP)、链霉素(streptomycin,SM)及乙胺丁醇(ethambutol,EMB)]、二线抗结核药物[左旋氧氟沙星(levofloxacin,LFX)、丁胺卡那霉素(amikacin,AK)、卷曲霉素(capreomycin,CPM)、乙硫异烟胺(ethionamide,TH)及对氨基水杨酸(p-aminosalicylic acid,PAS)]敏感性分析,采用BACTEC MGIT960培养系统进行一线抗结核药物及吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)抗生素敏感性分析。结果经比例法分析,不同卡介菌亚株均对一线抗结核药物敏感,除对TH耐药外,对其他二线抗结核药物均敏感;经BACTEC MGIT960系统分析,不同卡介菌亚株对RFP、SM、EMB均敏感,对PZA均耐药;卡介菌亚株BCG Pasteur 1173及BCG Tokyo172对INH敏感,而BCG Danish 1331菌株及中国卡介菌菌种BCG D2 PB302、BCG NIFDC 945 SⅢ均对INH耐药。结论中国生产用卡介菌菌种BCG D2 PB302及BCG NIFDC 945 SⅢ在抗生素敏感性方面与BCG Danish1331菌株一致,与其他亚株有差异。     

我国水痘-带状疱疹病毒VZV84-7减毒株基因特征研究

目的　建立水痘 带状疱疹病毒 (VZV)毒株的特异性鉴定方法 ,研究我国分离的VZV84 7减毒株(VZV84 7株 )基因特征。方法　利用PCR分别扩增VZV84 7株和Oka株R2和R5可变区基因 ,比较两者串联重复单位拷贝数 ;用PCR结合限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)分析VZV84 7株和Oka株基因的BglI、PstI酶切位点突变 ;并对gpI编码区基因进行序列分析。结果　VZV84 7株R2、R5区PCR产物分别为 4 2 5bp和 2 5 5bp ,对应的串联重复单位拷贝数分别为 7和 1;Oka株R2、R5区PCR产物分别为 4 2 5bp和 36 7bp ,对应的串联重复单位拷贝数分别为 7和 2。VZV84 7株基因存在PstI酶切位点 ,而Oka株无PstI酶切位点 ;两者均存在BglI酶切位点。基因序列分析显示 ,VZV84 7株与Oka株在gpI区存在 4个碱基差异 ,并导致 1个编码氨基酸不同 ,氨基酸序列同源性为99 8%。结论　所建立的PCR和PCR RFLP方法简便、特异 ;VZV84 7株的基因特征与Oka株存在一定差异 ,但两株之间gpI编码区氨基酸序列具有较高的同源性     

在大肠杆菌K99(中国QH株)菌毛形成亚单位基因(fanC)的克隆和测序中发现IS1 插入序列

目的 构建大肠杆菌K99菌毛表达载体。方法 通过逐级亚克隆的方法克隆k99菌毛形成亚单位基因（fanC），并进行序列测定和fanC亚单位的抗原决定簇模拟，以确定突变部位。结果 克隆了包括K99菌毛形成亚单位基因（fanC）和部分fanD基因在内的一段基因，该基因与国外报道相比明显偏大。序列测定表明：在fanC尾部多出 24bp，在fanC与 fanD，的结合部有一 800bp左右的新基因。经与基因库中大肠杆菌基因作同源性比较发现，该新基因为768bp的插入序列IS1。其他基因为K99自身fonC与fanD片段之间的过渡基因。IS1的插入未改变fanD，基因的阅读框架，只是使fanD片段末端增加了 8个氨基酸。fanC亚单位的抗原决定簇模拟结果显示，K99 fanC片段具有一个非常突出的亲水区域，根据经验它应是抗原决定簇所在的部位。结论 首次发现大肠杆菌K99基因中含有插入序列IS1。     

钩端螺旋体外膜蛋白基因重组载体构建及在卡介菌中的表达

目的　研制一种高效广谱的新型钩体疫苗。方法　用PCR方法扩增致病性钩端螺旋体赖型 0 17株外膜蛋白OmpL1基因 ,将其克隆入大肠杆菌—分枝杆菌穿梭质粒载体pMV2 6 1和pMV36 1中。结果　筛选到两个重组载体pBQ1和pBQ2 ,通过电穿孔导入卡介菌 ,重组体经诱导表达了相对分子质量约为 35 0 0 0的融合蛋白。结论　卡介菌能有效表达钩体抗原蛋白     

1株致病性黄疸出血群钩端螺旋体病流行菌株与其同血清群疫苗株的比较基因组学分析

目的 对1株致病性黄疸出血群钩端螺旋体（简称钩体）病流行菌株与其同血清群疫苗株进行比较基因组学分析。方法 应用高通量测序技术对黄疸出血群钩体流行株200502（简称流行株200502）进行全基因组序列测定,并与其同血清群疫苗株56601进行比较基因组学分析;选取GenBank中已公布的包括疫苗株56601在内的9株不同基因种的代表性钩体菌株构建系统发育进化树。结果 流行株200502全基因组序列全长为4 543 190 bp,含有编码基因3 580个,其中具有直系同源簇（clusters of orthologous groups,COG）功能2 192个。流行株200502与疫苗株56601基因组平均核苷酸一致性为99.2%,存在共有基因3 245个,流行株200502含有特有基因242个。以疫苗株56601为参考,在流行株200502中共鉴定出2 005个插入缺失（indel）和19 799个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点,其中编码区有8 485个同义SNP位点、3 484个非同义SNP位点,涉及菌株的细胞运动、信号转导机...     

皮内注射用卡介苗特异性鉴别试验多重PCR检测方法的建立及验证

目的建立皮内注射用卡介苗(Bacillus Calmette Guerin vaccine,BCG)特异性鉴别试验的多重PCR法,并进行验证。方法根据GenBank登录的Pasteur 1173P2株序列(AM408590. 1)设计并合成引物,以制备的BCG特异性鉴别试验国家参考品(简称BCG鉴别参考品)DNA为模板,多重PCR法扩增其特异性缺失区RD1,产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定,验证方法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度;采用该方法检测8批皮内注射用BCG供试品。结果 BCG鉴别参考品在重复检测6次、2名检测人员分别重复检测3 d、不同PCR退火温度及不同DNA聚合酶加量时均扩增出约200 bp的核酸片段;最低可检10 pg/mL的目的基因,仅对结核分枝杆菌H37Rv及皮内注射用BCG样品DNA扩增出特异性条带。经该方法检测,8批供试品PCR产物电泳均可见单一的目的条带,无RD1序列存在,大小与BCG鉴别参考品一致。结论多重PCR法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度良好,可应用于皮内注射用BCG特异性鉴别试验。     

卡介菌多糖核酸相对分子质量分布及其热稳定性

目的 测定卡介菌多糖核酸相对分子质量分布,并观察其热稳定性。方法 采用高效液相分子筛凝胶色谱法测定相对分子质量,并用煮沸或高压强热处理。结果 用该法测定卡介菌多糖核酸相对分子质量分布,有2个色谱峰,第1峰峰值相对分子质量为783 000,第 2峰为 3 200,面积分别为 21％和 79％。热处理后,其第 1峰相对分子质量大约有8％解聚合成第2峰。结论 卡介菌多糖核酸相对分子质量分布集中在3200,约占80％,对热较为稳定。     

The positional distribution of fatty acids in the phospholipids and triglycerides ofMycobacterium smegmatis andM. bovis BCG

Position 1 of the phospholipid and triglyceride fractions isolated fromMycobacterium smegmatis andM. bovis BCG was esterified principally with C₁₈ related fatty acids (18∶0, 18∶1 and 19Br). Position 2 was occupied principally by C₁₆ fatty acids. The third position of the triglycerides was esterified with a preponderance of C₂₀+fatty acids. Seventysix per cent of position 3 fatty acids in BCG and 43% inM. smegmatis triglycerides contained fatty acids of greater than 20 carbon atoms.     

Deletion of the Spata3 Gene Induces Sperm Alterations and In Vitro Hypofertility in Mice

Thanks to the analysis of an Interspecific Recombinant Congenic Strain (IRCS), we previously defined the Mafq1 quantitative trait locus as an interval on mouse Chromosome 1 associated with male hypofertility and ultrastructural abnormalities. We identified the Spermatogenesis associated protein 3 gene (Spata3 or Tsarg1) as a pertinent candidate within the Mafq1 locus and performed the CRISPR-Cas9 mediated complete deletion of the gene to investigate its function. Male mice deleted for Spata3 were normally fertile in vivo but exhibited a drastic reduction of efficiency in in vitro fertilization assays. Mobility parameters were normal but ultrastructural analyses revealed acrosome defects and an overabundance of lipids droplets in cytoplasmic remnants. The deletion of the Spata3 gene reproduces therefore partially the phenotype of the hypofertile IRCS strain.     

不同菌种卡介苗人体免疫应答比较

我们于1983～1991年,分别用六株菌种制备的六种试制苗和全国五个生物制品研究所生产的5种成品苗,在杭州市、大连市和辽宁省3个点,对17524名新生儿接种,分别于接种后不同时间用PPD作皮肤试验进行免疫反应观察。结果表明,试制苗大连点12周的阳性率以上海株苗、巴西株苗为高,北京株苗为低;5年持续阳性率以上海株苗为最高,北京株苗为最低。在杭州点,以上海株苗和日本株苗为最高,亦以北京苗为低。成品苗杭州点和辽宁点12周的阳性率以上海所苗为最高,兰州所苗为最低。综合评议均以上海所苗为优。其淋巴结化脓仅出现在活菌数较高的制品中,发生率不超过1‰。     

狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3区缺失转移表达载体的构建及表达

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞系统中高效表达。方法将含狂犬病毒SRV9株糖蛋白(Rgp)cDNA的pGT载体,经双酶切后回收Rgp基因片段,与经双酶切的真核表达载体pIRES1neo连接,得到pIRES1Rgp,再经双酶切后回收2623bp片段,与E3缺失载体pBE3L连接,得到含狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体pBE3LCRgp,再转染MDCK细胞。结果pBE3LCRgp转染的MDCK细胞,经间接ELISA和间接免疫荧光法在其培养上清中均能检出Rgp的高效表达。结论已成功构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞中高效表达。     

甲型肝炎病毒(H2株)快速适应变异株全基因序列分析

目的 探索甲型肝炎病毒（Ｈ２株）细胞适应的分于机制。方法 将甲型肝炎减毒活疫苗毒株（ＨＡＶ Ｈ２Ｋ７）在人胚肺二倍体细胞ＫＭＢ１７上快速连续传代增强适应（１４ｄ）,检测连续传代后抗原滴度和感染性滴度,测定 第１８代（ＨＡＶ Ｈ２Ｋ７Ｐ１８）全基因组序列。结果 适应至第１８代抗原滴度达１：５１２,感染性滴度为７．５ＬｏｇＣＣＩＤ５０／ｍｌ。 整个基因组出现了１０个核苷酸突变,变异卒为０．１３％,变异较大区域位于５’末端非编码区（５’ＵＴＰ）,有３个核苷酸 变异。编码区７个交变,２个是无义突变,５个有义突变导致５个氨基酸变化,分别位于 ＶＰ２ Ａ－Ｓ;２Ｃ,Ｑ－Ｐ;３Ａ,Ｒ－ Ｃ;３Ｃ,Ｔ－Ａ和３Ｄ,Ｖ－Ｇ。结论 ＨＡＶ Ｈ２Ｋ７４因组５’ＵＴＲ、２Ｃ区、３Ａ区、３Ｃ区和３Ｄ区变异协同作用促进在 ＫＭＢ１７ 细胞上快速增强适应。     

Effects of diet and type IIa hyperlipoproteinemia upon structure of triacylglycerols and phosphatidyl cholines from human plasma lipoproteins

Four normal and two individuals with Type IIa hyperlipoproteinemia were placed on the National Heart and Lung Institute Type IIa diet (low cholesterol, smaller than 300 mg/day, high polyunsaturated, low saturated fat diet) for 1 week and on a normal diet the following week. Plasma samples were obtained and the triacylglycerols, phospholipids, and cholesterol contents of plasma and of very low density lipoproteins, low density lipoproteins, and high density lipoproteins determined. Triacyglycerol fatty acid composition was determined and stereospecific analyses of triacglycerols and phosphatidyl cholines performed. Structural determinations were limited to one normal and one Type IIa individual. In normal and Type IIa individuals, chylomicrons contained twice the amount of 18:0 as did the very low density lipoproteins, low density lipoproteins, or high density lipoproteins. The structure of the triacyglycerols from the very low density lipoproteins and low density lipoproteins was asymmetric with at least 50M% 16:0 in the sn-1 position and mostly 18:1 in positions sn-2 and 3. There was a marked difference in the distribution of 18:2 in low density lipoproteins of the normal and Type IIa individuals. The control contained equal amounts of 18:2 in the sn-1 and sn-3 positions, whereas IIa low density lipoprotein was asymmetric with 26% of the 18:2 in position sn-1 and 3% in the sn-3 position. Very low density lipoprotein was asymmetric with regard to 18:2 in control and IIa samples with an average of 5% of the 18:2 in position sn-1 and 40% in position sn-3. The phosphatidyl cholines contained predominantly 16:0 and 18:0 in position sn-1, whereas the acids in position sn-2 were unsaturated with very little difference between lipoprotein classes. Neither the short dietary periods nor source of plasma affected the structure of the phosphatidyl cholines.     

硫酸盐废水处理系统强化菌株的分离鉴定及功能基因分析

引言 硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)在自然界硫循环中起着重要作用,由于其主要代谢产物硫化氢的毒害性和腐蚀性,而备受石油开采、废水处理和管线保护等行业的关注.