玉米半胱氨酸蛋白酶的真核表达及酶学性质表征

玉米半胱氨酸蛋白酶是一种重要的蛋白水解酶,作为C1家族蛋白酶的一员,可在食品、医药等领域广泛应用。本研究从玉米幼苗中提取总RNA,反转录扩增得到玉米半胱氨酸蛋白酶基因,进而构建重组真核表达载体pPICZα-zmCP1,转化毕赤酵母GS115构建重组菌。对表达的玉米半胱氨酸蛋白酶进行酶学性质研究,结果表明该酶最适反应温度为55 ℃,最适反应pH值为6.0,具有较好的热稳定性和有机溶剂抗性,但是pH值的稳定性、金属离子耐受性表现一般。底物特异性研究发现,该酶对小分子底物具有较强的水解能力,且偏爱P1位点为精氨酸的底物。     

玉米半胱氨酸蛋白酶突变体W308C的原核表达和酶学性质表征

通过对玉米半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease from Zea mays,zmCP1）同源模建和底物对接研究发现,W308位点在木瓜蛋白酶家族（C1家族）高度保守,且位于zmCP1催化三联体残基N306位点附近,与绝大多数底物形成π-π键,可参与底物和酶活性中心的结合,是该酶的关键位点;结合Rosetta design程序设计,对W308位点进行突变,获得W308C突变体,并在大肠杆菌BL21中表达。酶学性质表征实验结果表明：突变体W308C的最适温度为55 ℃,最适pH 6.0;在70、80、90 ℃下的半衰期为75.33、57.24、40.29 min,分别是野生型的1.21、1.19、1.01倍;突变体W308C和野生型的特异性常数Kcat/Km分别为11.02、5.92 L/（μmol·min）,催化活性提高了0.86倍。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶五突变体的构建及酶学性质表征

目的:天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)是催化天冬氨酸族氨基酸合成的第一个关键别构酶,为了提高其活力,并削弱或解除末端产物赖氨酸(Lys)与苏氨酸(Thr)对AK的协同反馈抑制.方法:在获得的北京棒杆菌四突变体T379N/A380C/G171I/Y198NAK(NCINAK)的基础上,发现G295位...     

茶树单宁酶的原核表达及酶学性质表征

基于大肠杆菌的密码子偏好性,对茶树单宁酶基因CsTanA碱基进行优化,基因优化后GC含量为51.9%,密码子适应指数为0.8,优化前后基因序列的一致性为77.8%,以pET-30a为表达载体对优化基因进行重组表达及酶学性质分析。A600 nm约0.6的重组菌株以1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在30 ℃诱导12 h,破碎上清液重组单宁酶rCsTanA比活力为0.35 U/mg,镍柱纯化后的rCsTanA比活力为1.53 U/mg,纯化倍数约为4.4。纯化重组单宁酶rCsTanA分子质量为39 kDa,其最适温度和最适pH值分别为40 ℃和7.0。不同金属离子浓度对酶活力的影响存在差异,在低浓度（1 mmol/L）条件下,K＋增强了rCsTanA 37.28%的酶活力,而Ag＋、Cu2＋和Fe3＋使该酶活力均丧失80%以上;而在高浓度（5 mmol/L）条件下,Cu2＋表现出完全抑制rCsTanA活性的特性。表面活性剂（十二烷基硫酸钠、吐温80和十六烷基三甲基溴化铵）和极性溶剂（甲醇、乙醇、丙三醇、异丙醇及丙酮）对rCsTanA活性具有较强抑制作用。本研究不仅实现了茶树单宁酶的表达和酶学性表征,同时也丰富了单宁酶资源,为植物单宁酶的进一步应用研究提供了必要的理论支撑。     

天冬氨酸激酶突变体G277K中AK基因的克隆表达及酶学性质表征

通过序列比对和晶体结构分析发现,天冬氨酸激酶（aspartokinase,AK）的G277位点高度保守,并与抑制剂Thr通过氢键相连,对其进行定点突变和酶学性质表征。结果表明：突变体G277K的AK最适反应条件是30 ℃、pH 8.5;动力学实验结果显示突变体AK的正协同效应降低,趋向于米氏酶,参数S0.5、nH、酶比活力、Vmax分别是7.05 mmol/L,1.24、964.3 U/mg、32.143 U/（mg·min）;热稳定性实验显示,其30 ℃半衰期为2.3 h,3 h后酶活力丧失80%左右;Ni2+在低浓度时表现出显著的激活效应;有机溶剂丙三醇、异丙醇和二甲基亚砜的体积分数为1%时,对AK的酶活力有很好的激活作用,表明突变体AK对一些有机溶剂有一定的抗性;低浓度的赖氨酸和蛋氨酸对AK有激活作用。     

外切型琼胶酶AgaO的高效表达及酶学性质表征

根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明,重组酶rEAgaO在16 ℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导20 h时表达量最高;95%以上的重组蛋白质为水溶性表达,产量约为1432.7 mg/L,较优化前原始基因的产量提高了10.9倍;重组酶rEAgaO的最适反应温度为45 ℃,在低于40 ℃的温度下预处理2 h后,仍然具有90%以上的残余活性,最适pH为7.0,在pH6.0~10.0不同缓冲体系4 ℃处理2 h仍保留69.5%以上的活性;该酶降解琼脂糖后的最终产物经TLC分析鉴定为新琼二糖。基因密码子优化虽不改变蛋白质氨基酸序列,但可明显提高水溶性重组蛋白质的产率及酶活,对促进相关酶类的生产和应用具有借鉴意义。     

鲍鱼褐藻胶裂解酶基因的原核表达及酶学性质

褐藻胶寡糖因其内在的生物功能具有良好的应用前景,褐藻胶裂解酶可将褐藻胶降解为褐藻胶寡糖,基因工程技术为高效生产褐藻胶裂解酶提供了技术方法。从鲍鱼肝胰腺中提取RNA,通过RT-PCR得到cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增得到褐藻胶裂解酶基因algl,将其与pET-28a(+)载体连接,并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达。将工程菌体超声波破碎后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,利用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化重组蛋白Algl,继而对其进行酶学特性研究。细胞破碎物酶活检测及SDS-PAGE分析表明,重组蛋白为包涵体,相对分子量约为32 000。包涵体纯化、复性后的酶活为15.6 U/mL,比酶活为644.6 U/mg。纯化后的工程酶酶学性质研究表明:该酶最适温度35℃;最适pH值为8.0;只能降解多聚甘露糖醛酸(polyM)而不能降解多聚古洛糖醛酸(polyG);催化褐藻胶的K_m值为1.71 mg/mL,V_(max)为19.08 U/mL。重组酶Algl对多聚甘露糖醛酸的底物特异性和适冷性具有潜在的生物技术和工业应用。     

阿魏蘑漆酶同工酶的异源表达及酶学性质研究

共培养是提高漆酶发酵水平的一种有效手段,实验室前期研究发现,较之单培养,在阿魏蘑与胶红酵母的共培养过程中,阿魏蘑漆酶基因lacc2和lacc6的转录水平发生了明显变化。通过克隆得到阿魏蘑漆酶基因lacc2和lacc6,异源表达后对2个重组漆酶LACC2和LACC6进行分离纯化和酶学性质分析。以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate), ABTS]为底物时,LACC2和LACC6的最适反应温度和pH相同,分别为50℃和3.0;低浓度的K⁺、Cu²⁺、Co²⁺和Mn²⁺对2个重组酶有不同程度的促进,但对LACC2的促进作用更为明显;与LACC6相比,LACC2对有机试剂和表面活性剂的耐受力更强,但更容易受到抑制剂的影响;动力学研究发现,LACC2和LACC6的最适底物均为ABTS,K_m值分别为0.13和0.24 mmol/L。研究结果为共培养过程中胶红酵母促进阿魏蘑产...     

Vibrio natriegens几丁质酶基因的异源表达及酶学性质研究

几丁质是自然界中除纤维素外第二多的多糖聚合物,在几丁质酶的作用下生成的几丁寡糖具有较好的生物活性及应用价值.通过分子生物学手段获得高活性重组几丁质酶,有利于实现虾壳等几丁质资源的高值化利用.对来源于Vibrio natriegens中的几丁质酶基因进行克隆及诱导表达,获得重组几丁质酶VnChit4,然后通过亲和层析对该...     

壳聚糖酶的基因克隆表达及酶学性质研究

作者从NCBI数据库中挖掘到来源于Butyrivibrio sp. MC2013的壳聚糖酶基因,命名为BUT,该壳聚糖酶基因大小为903 bp,编码301个氨基酸。通过NCBI数据库和进化树比对发现,该壳聚糖酶（BUT）属糖苷水解酶46家族（后简称GH-46）,与其它壳聚糖酶相似度为59%,是一种新型的壳聚糖酶。序列经密码子优化后进行全基因序列合成,与表达载体pET21a（+）连接构建重组质粒pET-21a-BUT,转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）表达宿主,进行诱导表达。所得重组壳聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,SDS-PAGE确定其蛋白分子量为35 kDa,DNS法测定其酶活为146.0 U/mg。对BUT酶的酶学性质进行探究,结果表明BUT酶最适温度和pH分别为45 ℃、8.0,在中性偏碱性条件下稳定性较强。Mn2+对其酶活力具有促进作用,SDS、Fe3+、Cu2+、Zn2+等的抑制作用极强。通过TLC对其水解产物分析发现,BUT水解壳聚糖的产物是壳二糖、壳三糖和壳四糖。     

杂合抗菌肽Me-HNP1真核表达载体的构建与初步表达

选择蜂毒肽(Melittin)和人体防御素(HNP-1)部分基因序列进行人工融合,通过生物信息学技术预测其理化性质和功能结构,依据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏爱性原则编码杂合肽Me-HNP1基因,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增目的基因并定向克隆至穿梭型表达载体pPICZa A上,将构建成功的分泌表达载体pPICZαA-Me-HNP1通过电转化的方式转化到毕赤酵母感受态细胞GS115内,以甲醇为诱导剂进行诱导表达,将得到的粗蛋白进行分离纯化。Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳在5 kDa处得到一条单一清晰条带,表明杂合抗菌肽Me-HNP1在毕赤酵母中成功表达,生物信息学分析得出杂合抗菌肽Me-HNP1分子内带有8个正电荷,等电点为9.55,脂溶性80.44,在酵母体内半衰期大于20 h。表明其具有成为优秀抗菌肽潜力。为抗菌肽的研究奠定了实验基础。     

重组人凝血酶真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目的 构建含重组人凝血酶基因的重组真核表达载体,并转染哺乳动物细胞CHO,建立稳定表达重组人凝血酶的细胞株.方法 利用限制性内切酶EcoR I和XbaI将凝血酶基因插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建含人凝血酶基因的重组质粒pcDNA3.1 （＋）/thrombin,利用双酶切和测序法鉴定.采用阳离子脂质体介导方法,将构建的表达载体转染到CHO细胞中,通过G418加压筛选出阳性细胞克隆,建立稳定表达人凝血酶的细胞株,并扩大培养.采用RT-PCR和SDS-PAGE法检测其mRNA和蛋白质的表达,并对其生物活性进行鉴定.结果 重组质粒pcDNA3.1 （＋）/thrombin经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误;经RT-PCR和SDS-PAGE法鉴定,转染的CHO细胞可表达、分泌人凝血酶,得到的重组人凝血酶表观相对分子质量（Mr）为43000左右,与预测一致,且具有降解并凝固牛纤维蛋白原的活性,其比活为234.1 U/mg.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 （＋）/thrombin,并成功地在CHO细胞中表达了具有生物活性的重组人凝血酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人凝血酶奠定了基础.     

带有突变穿膜肽重组凋亡素可溶性表达的研究

目的构建apoptin（凋亡素）-HBDCK-pET28a突变体重组表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现高效可溶性表达,并观察突变后穿膜肽（CPP）在HeLa细胞中的转导活性。方法采用PCR介导突变方法将重组蛋白apoptin-HBD及EGFP-HBD的HBD结构域中的Cys（C）突变为Lys（K）。突变的重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,Ni2＋-NTA亲和层析纯化目的蛋白,进一步观察HeLa细胞突变后HBD的转导活性。结果经双酶切鉴定和序列分析,突变后的重组质粒apoptin-HBDCK-pET28a及EGFP-HBDCK-pET28a构建正确。转化E.coli BL21（DE3）后,融合蛋白均获得可溶性表达。EGFP-HBDCK作用于HeLa细胞13 h后,可观察到细胞内强绿色荧光。结论 HBD结构域中C突变为K,可达到融合蛋白可溶性表达的目的,且仍能保持很强的转导活性,可携带EGFP蛋白进入HeLa细胞。     

抗菌肽Japonicin II基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin II基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上,经PCR鉴定及序列分析,所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin II基因的重组质粒pPICZαA-Jap,结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinII基因真核表达载体pPICZαA-Jap。     

水生栖热菌海藻糖合成酶基因的克隆及真核表达

通过基因工程技术合成海藻糖合酶Tres 全基因,插入到毕赤酵母菌表达载体pPICZα中。电转化毕赤酵母菌GS115 后,经Zeocin 抗性筛选阳性菌株。用PCR 和全基因测序鉴定目的基因的表达。通过诱导表达目的蛋白,并以SDS-PAGE 和Western blotting 进行鉴定。成功地构建了pPICZα-Tres 重组质粒,并证明目的基因已整合于毕赤酵母菌的基因组。