中间香型烤烟叶面腺毛形态及分泌特性研究

以贵州省遵义市中间香型烟叶典型生态区的代表品种K326为材料,采用显微观察、GC/MS及RT-PCR技术,对叶面腺毛进行了形态观察、化学成分检测及基因表达分析。结果表明:腺毛密度随叶片发育呈下降趋势,在叶龄20 d时下降幅度最大;腺毛主要分泌物中西柏烷类化合物含量最高,并在叶龄70 d达到最高水平;西柏烷类化合物合成关键基因西柏三烯一醇合成酶基因(cembratriene-ol synthase gene,CYC-1)及西柏三烯一醇羟化酶基因(cembratriene-ol hydroxylase gene,CYP71D16)在20 d、40 d和70 d时表达较强,呈现出与化学成分变化类似的趋势,推测认为CYC-1和CYP71D16的表达可影响西柏烷类化合物的含量。     

不同品种烤烟鲜叶表面提取物的主要成分分析

选择贵州省4个主要烟草品种,分下、中、上3个部位采收成熟鲜叶,用二氯甲烷提取叶表面物质进行分析检测。结果表明,烤烟鲜烟叶表面提取物主要包括烟碱、酮类、萜烯类和烷烃类。烟碱含量最高,酮类含量甚微。萜烯类物质是烟草叶表面提取物的主要成分,主要是西柏烷类,包括西柏烷、西柏三烯一醇和西柏三烯二醇。西柏三烯二醇含量高于西柏三烯一醇,β-西柏三烯醇二醇含量较α-西柏三烯醇二醇稍多。烷烃类主要是三十烷以上的高级烷烃,含量较多。不同品种鲜叶表面提取物总量存在明显差异,南江3号最低,K326次低,贵烟201较高,云烟85最高。     

典型烤烟品种腺毛形态及分泌特性比较分析

为探讨烤烟叶面化学特征及其形成机制,本文以K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、豫烟11等代表性烤烟品种为试验材料,采用超景深显微技术、GC-MS分析检测技术和荧光定量PCR技术,对叶面腺毛形态、叶面化学成分以及腺毛分泌物合成关键基因表达进行了比较分析。结果发现:（1）烤烟腺毛由长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和非分泌保护毛等不同类型组成,翠碧1号和豫烟11中分泌型腺毛含量较高,而中烟100中非分泌型腺毛相对丰富。（2）西柏烷类化合物是烤烟叶面的主要化学成分,以K326中的含量为最高;赖百当类化合物在烤烟中含量极少,但豫烟11中顺冷杉醇和赖百当二醇含量较高。（3）西柏烷类合成酶关键基因CYC和CYP71D16在K326中表达活跃,赖百当合成酶关键基因CPS2在豫烟11中的表达量明显高于其它品种。不同烤烟品种之间叶面腺毛形态、基因表达及分泌物含量所存在的明显差异,可能与品种特色密切相关。      

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。      

基于CRISPR/Cas9技术的烟草CPS2基因敲除及功能分析

为明确柯巴基焦磷酸合酶基因(CPS2)的功能和调控机制,利用CRISPR/Cas9技术对高香气烤烟品系8306中的CPS2基因进行定向编辑,得到了7株靶位点单碱基A/T/C插入的转化植株。利用q-PCR技术分析转化植株二萜类关键基因的表达,并利用GC/MS分析叶面分泌物成分及香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)含量(质量分数)。结果表明:(1)T0代转化植株CPS2及ABS表达量显著降低,冷杉醇和赖百当烯二醇含量也显著降低。(2)DXR表达量均显著升高,GGPP含量也大幅提高。(3)CYC-1和CYP71D16表达量差异较大,西柏三烯二醇出现小幅降低。(4)T0代转化植株的株高、茎围、叶间距、最大叶长、最大叶宽均增加。因此,敲除CPS2能够抑制赖百当类化合物合成,有助于上游途径中萜类合成前体GGPP的积累,可能抑制西柏三烯二醇积累,同时使植株表型性状发生变化。     

典型生态区烟叶腺毛发育及其分泌物比较研究

以烟草品种K326为材料,分别种植在河南平顶山、贵州遵义和云南江川三个典型生态区,在烟草叶片发育过程中对叶面腺毛形态、密度、腺毛分泌物及基因表达水平进行了比较研究。显微观察发现腺毛类型在3个地区间变化不大,都以长柄多腺头腺毛为主,但腺毛密度以贵州遵义产区的烟叶最高,河南次之,云南最低;GC/MS检测表明,西柏三烯二醇含量以河南产区为最高。且河南和云南产区随叶龄变化趋势相同;RT-PCR分析表明,西柏烷类化合物合成关键酶基因CYC-1和CYP71D16转录水平的表达与西柏三烯二醇含量的变化趋势一致。该研究表明生态环境对烟草腺毛发育和物质代谢具有较大影响,典型生态区烟叶叶面化学的差异可能与烟叶的风格特色密切相关。      

清香型烟叶产区基因型选择

  目的  为清香型产区烤烟基因型选择提供依据。  方法  在清香型烟叶主产区云南和福建种植11个烤烟基因型,利用系统聚类方法对参试基因型常规化学成分、多酚物质、挥发性香气物质含量及感官评价得分进行单类别指标和所有指标综合的聚类分析。  结果  1）云烟116与云烟87、NC71与PVH1452、云烟110与云烟119的单类别指标及所有指标综合聚类均分别聚在相同类群,化学成分及感官质量相似性较高,其他基因型间单类别指标和所有指标综合聚类的差异较大。2）感官评价聚为Ⅰ类群的云烟116、云烟87、K326清香型风格较典型,感官质量好,相似性较高。3）茄酮、降茄二酮、正己醛、2-异丙基-5氧-己醛、寸拜醇、西柏三烯二醇（a、b、c、d）含量与感官质量显著或极显著正相关,绿原酸含量与感官质量显著负相关,这些指标在基于感官评价聚类的类群间差异具有统计学意义。  结论  云烟116、云烟87、K326清香型风格较典型,感官质量好,感官质量及多酚物质含量相似性较高,云烟116与云烟87感官质量及化学成分相似性较高。研究结果可为清香型产区基因型选择提供依据。      

我国烟草资源西柏三烯二醇含量分析

  目的  了解我国烟草资源腺毛分泌西柏三烯二醇含量特征。  方法  用超高效液相色谱（UPLC）法测定并分析了不同器官、叶位以及不同烟草类型、品种间西柏三烯二醇特征。  结果  （1）同一生长时期,烟花中西柏三烯二醇均高于其他器官;随叶位升高,烟草叶片西柏三烯二醇均呈升高趋势。（2）540份烟草种质均检测到西柏三烯二醇;烤烟西柏三烯二醇含量最高,其他类型烟草差异不显著,不同类型烟草α与β-西柏三烯二醇异构体的比值也存在差异;（3）筛选了富含西柏三烯二醇（大于2%）的烟草种质28份,其最高含量达3.46%。（4）根据特色烤烟品种红大及香料烟品种沙姆逊分析结果,西柏三烯二醇含量差异是烟草香吃味品质差异的重要化学成分基础。      

烤烟致香物质含量和腺毛密度的基因型差异

采用田间试验和气相色谱-质谱联用法分析及电镜扫描,对不同基因型烤烟致香物质含量和腺毛密度差异进行了研究。结果表明,烟叶的致香物质含量与基因型密切相关,不同基因型烤烟致香物质总量存在显著差异,具体表现为兴烟1号>K326>云烟87>贵烟4号;不同基因型烤烟主要类别致香物质含量存在差异,其中云烟87的类西柏烷类、苯丙氨酸类和棕色化产物类致香物质含量较高,而兴烟1号的类胡萝卜素类和新植二烯致香物质含量较高;不同基因型烤烟叶面腺毛密度存在差异,兴烟1号的腺毛密度最大,其次是K326,云烟87的腺毛密度最小。     

氮素对烤烟基因型间香味基础物质及相关性状的影响

为研究氮素对不同烤烟基因型香味基础物质及相关性状的影响。以高香气烤烟新品系8306、高香气杂交种Y892和常规烤烟品种K326、中烟100 为材料,对不同氮肥水平下不同香气特征基因型烤烟的质体色素含量、叶面分泌物含量等香味基础物质相关性状的变化特征和差异进行了分析。结果表明,中氮水平下,各基因型类胡萝卜素含量最高;8306 和Y892类胡萝卜素的积累速度要高于K326 和中烟100;中氮处理的叶面分泌物含量在各个叶龄期均高于低氮处理和高氮处理;8306和Y892 在中部烟叶叶面分泌物含量最高期高于K326 和中烟100;不同基因型烤烟氮素的代谢积累有较大差别;不同基因型烤后烟叶中性香气基础物质总量,随氮用量增加8306 的含量升高,K326 的含量降低。以提高烟叶香气基础物质含量为目标的栽培管理中要根据品种特点进行氮肥运筹。     

烤烟品种大白筋599特征香气性状的物质及分子基础研究

为探索大白筋599特征香气性状的关键致香物质基础和分子机制,为特香型烤烟品种培育及工业利用奠定基础,通过不同品种（系）的表面分泌物检测及烟叶感官鉴定比较,明确大白筋599特征香气性状关键致香物质基础;通过对不同品种中调控关键致香物质合成的基因进行测序,明确大白筋599特征香气性状形成的分子基础。结果表明,烤烟品种大白筋599和香料烟品种Samsun表面分泌物中含有赖百当二萜冷杉醇,而普通烤烟G28等均不含冷杉醇。普通烤烟G28与大白筋599杂交或回交的后代品系中,含有冷杉醇的均具有大白筋599特异香气特性,不含冷杉醇的没有特异香气特性。调控冷杉醇合成的关键基因NtCPS2的第292位碱基在不同品种间具有多态性,在大白筋599中是野生型碱基G,而在供试普通烤烟及生产主栽品种中是突变型碱基T。冷杉醇是烤烟品种大白筋599特异香气性状形成的关键致香物质。调控冷杉醇合成的关键基因NtCPS2的第292位碱基在大白筋599及供试普通烤烟品种和主栽品种间的SNP多态性,是导致其香气特征差异的主要原因。通过遗传改良,丰富烟草表面分泌物中致香成分的种类和含量,是培育特色香气风格烤烟品种的重要途径。     

贵州烟区烤烟烟叶香气物质分析

为明确贵州烟区烤烟烟叶香气物质差异,并依据香气物质对贵州烟区烟叶进行分类,采用正己烷常温萃取法和液相-气相-质谱联用技术对贵州10个地区烤烟烟叶香气物质含量进行测定。结果表明,贵州烟区不同品种间烟叶香气物质差异较小,而不同叶位间和不同地区间差异较大,贵州烟区不同地区中部烟叶巨豆三烯酮等15种香气物质含量差异显著。主成分分析表明,巨豆三烯酮、茄酮和降茄二酮等是贵州烟区烤烟的关键香气物质;通过聚类分析将贵州烟区不同地区的烤烟烟叶划分为三类,第一类是德江、兴仁、西秀、道真和威宁;第二类为贵定、凯里、开阳和余庆;第三类为盘县。     

白肋烟香气物质与感官质量及调制条件的关系

研究了3种调制湿度对白肋烟20种香气物质含量与感官质量的影响,并讨论了二者的相关性。结果表明:①酮类化合物与感官评分显著相关,巨豆三烯酮、20种香气物质总量与感官评分较显著相关,茄酮与感官评吸得分之间具有一定的相关性;②吡嗪等物质与感官评分呈较显著负相关;③中湿调制有利于上、中部叶白肋烟重要香气物质的积累,特别是中湿调制的中部叶,其重要香气物质含量明显高于其他湿度调制的烟叶,低湿调制更有利于下部叶重要香气物质的积累。     

烤烟基因型间香味物质的差异分析

对高香气烤烟新品系"8306"等8个烤烟基因型进行香味成分的差异分析,旨在显示"8306"的高香气特性。用分光光度法测定叶面分泌物含量和残余法测定浸提后石油醚提取物的含量,用气相色谱/质谱联用仪(GC/MS)对"8306"和中烟100的香味物质含量和组成进行鉴定。结果表明,"8306"的叶面分泌物、石油醚提取物含量和总香值均较高,这可能是与其它基因型香气质量差异的主要原因。"8306"的20种含量较高成分可能是其高香气产生的主要物质基础。"8306"的总香气成分含量远高于中烟100,这可能是其香味突出的原因之一。     

烤烟和白肋烟互换调制方法对烟叶中性香气物质含量及感官质量的影响

为探究调制方法对烟叶中性香气物质含量的影响,分别在四川达州和云南大理以白肋烟和烤烟为材料设置田间试验,成熟采收后同一品种分别以烘烤和晾制两种方式进行调制,进而比较中性香气物质含量及感官质量。结果表明:烤烟及白肋烟在烘烤和晾制两种调制方法下中性香气物质组分差异较小,而各组分含量及比例存在显著差异。晾制条件不利于烤烟特征香气物质及新植二烯的积累,但可显著提高烤烟棕色化反应产物总量及茄酮含量;烘烤条件不利于白肋烟茄酮、芳樟醇、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯、法尼基丙酮的积累,但有利于白肋烟新植二烯、脱氢β-紫罗兰酮、氧化异佛尔酮、巨豆三烯酮、螺岩兰草酮及芳香族氨基酸降解产物的积累。烤烟在晾制条件下烤烟风格、香气质和甜感下降,刺激性增加,而白肋烟在烘烤条件下香气质改善,刺激性减少,甜感增加,但白肋烟风格程度明显下降。      

干旱胁迫后复水对烤烟生长及其生理特性的影响

  目的  为明确干旱胁迫后复水对烤烟生长及其生理基础的影响。  方法  采用盆栽试验方法,以耐旱型烤烟品种“豫烟6号”和水分敏感型“豫烟10号”为试验材料,设置正常供水、轻度干旱、中度干旱、轻度干旱后复水和中度干旱后复水5个处理,比较分析干旱胁迫后复水对烤烟生长及其生理特性的影响。  结果  （1）随着干旱的加剧,两个烤烟品种生长受到抑制,生理性能下降,株高、茎围、最大叶长、最大叶宽、最大叶面积、有效叶片数、根系干重和单株干重均降低或显著降低,叶绿素含量、净光合速率（P_n）、气孔导度（G_s）、蒸腾速率（T_r）、PSII最大光能转化效率（F_v/F_m）、PSⅡ实际光化学效率（Φ_PSⅡ）和光化学淬灭系数（qP）均显著降低,而非光化学猝灭系数（NPQ）、胞间二氧化碳浓度（C_i）、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性均显著增加;与正常供水相比,豫烟10号在干旱胁迫下各指标变化幅度大于豫烟6号,对干旱较敏感。（2）干旱胁迫后复水,与干旱处理结束时相比,两个烤烟品种生长得到明显恢复,光合作用增强,抗氧化系统平衡得到明显改善。豫烟10号在干旱胁迫后复水各指标变化幅度均大于豫烟6号,干旱胁迫后复水恢复较好。  结论  在干旱胁迫下,两个烤烟品种的生长和生理性能均受到不同程度的抑制,且均与正常供水处理间差异显著;复水后,两个烤烟品种的生长及其生理性能均得到不同程度的恢复,其多数指标均以中度干旱胁迫后复水处理恢复较好,且与正常供水处理无显著差异。      

鲜烟叶与烟花同烤对烤后烟叶质量的影响

为探讨烤烟烘烤调香新技术,采用“鲜烟叶+鲜烟花蕾同烤”(叶花同烤)与常规烘烤两种烘烤方法,比较烤后烟叶经济性状、外观质量、感官质量、常规化学成分含量和致香物质含量。结果表明,叶花同烤对烟叶经济性状、外观质量和常规化学成分影响较小,对感官质量和致香物质的含量影响较大。与常规烘烤相比,叶花同烤烤后烟上等烟比例提高了3.26个百分点;感官质量得分提高了2.90分,其中香气质和香气量有所增加,杂气和余味有所减少,且烟叶香韵风格有一定改善;叶内致香物质β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、茄酮、糠醛、5-甲基糠醛、β-环柠檬醛和3, 4-二甲基-2, 5-呋喃二酮的含量极显著增加;芳樟醇、香叶基丙酮、巨豆三烯酮类、3-羟基-β-二氢大马酮的含量显著增加。烤后烟花中上述致香物质含量显著减少。说明叶花同烤有增加烤后烟叶致香物质的作用。