人α_1型干扰素单克隆抗体在纯化人α_1型基因工程干扰素的应用

作者采用本所研制的人α_1型干扰素单克隆抗体,将人α_1型基因工程干扰素纯化至电泳纯级,平均得率为93％,平均比活性为6.5×10~6 IU/mg蛋白,平均提纯倍数为15倍。3次试验经SDS-PAGF银染色法测定,均呈一条带,在非还原电泳条件下扫描干扰素纯度均在100％,残余鼠IgG含量测定均合乎规程要求,证明人α_1型单克隆抗体用于纯化人α_1型基因工程干扰素效果良好。     

应用免疫印迹法检测基因工程人白细胞介素-2的特异性

基因工程人白细胞介素-2(rIL-2)样品首先经垂直SDS-PAGE按其分子量大小分开,再经电转移仪转到硝化纤维膜上,用小牛血清或牛血清白蛋白封闭空余位点后,加入鼠抗人卫IL-2单克隆抗体(DMS-1),室温作用1.5小时后洗膜,加入兔抗BALB/c鼠IgG-HRP,作用后加入二氨基联苯胺显色,以显色带的位置和带数来判断制品的特异性和纯度。我们的产品经显色后只见一条带,分子量为1.5万,未见多聚体,达到免疫纯。     

应用半干胶转移免疫印迹法分析人白细胞干扰素

应用半干胶转移仪和ABC-试剂盒，建立了高灵敏度的半干胶转移免疫印迹法并用该法分析了不同厂家生产的人白细胞干扰素．结果表明，该法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，很适用于人白细胞干扰素的检定．     

人α_1型基因工程干扰素的中间试制

带有杂交质粒pBV867的大肠杆菌BMH 71-18株,用高密度发酵培养法进行发酵,3批中试的平均菌产量为100.25克/升,粗制干扰素的表达量平均为8.39mg/升。3批粗制干扰素的数量分别为35000,30000和36000 ml。经初步提纯,分别浓缩10.4、10和11.29倍,比活性上升10、33和30倍,初步提纯的得率为34.33％。经高度提纯、浓缩23.8、16.7和26.1倍,比活明显增加至24.38、20.80和21.43×10~6 IU/mg蛋白,平均得率为35.92％,总得率为11.82％,平均提纯倍数为1757倍。 3批中试产品按WHO规程的标准进行检定,经SDS-PAGE银染色法测定,呈一条带,其分子量约为21000,无论在还原或非还原的条件下干扰素纯度均在95％以上。用HPLC检定均为单一峰形,纯度在95％以上。其它检定项目如等电聚焦、效价、热原、残余DNA、鼠IgG含量测定和全波长扫描等均合乎规程要求。     

α1b型基因工程干扰素大规模纯化工艺的建立

应用α1b型基因工程干扰素大规模纯化工艺制备了3批干扰素，每批使用16kg菌体，其干扰素平均得率和纯化倍数分别为11．55％和1659倍。按照WHO规程的要求，其纯度经SDS—PAGE银染色法检定，呈一条带，其分子量约为20KD，纯度在98．97％以上。用HPLC检定纯度均为单一峰形，纯度在96％以上。其它检定项目如残余DNA和鼠IgG含量、热原、水分和安全试验等均符合规程要求。     

应用概率单位法计算基因工程干扰素效价

目前，基因工程干扰素的效价测定，是采用细胞病变抑制法（CPE）。每毫升干扰素样品能保护半数细胞免受攻击病毒侵害的稀释度，其倒数（ITCD50）即为干扰素的效价（IU／ml）。它的计算用Reed－Muench法，现在我们用概率单位法与之比较，使用的是EL—5100编程计算器。根据等公式     

测定α_1型干扰素的ELISA夹心法

应用ELISA夹心法测定rHuIFNα1含量，其灵敏度为1．56ng／ml，批内CV4.2％，批间CV7．8％。应用此方法测定上海生物制品研究所生产的rHuIFNα1（20μg／支）两批含量分别为19．5μg／支及21.9μg／支。     

人α_1型基因工程干扰素单克隆抗体及亲和层析柱的研制

应用杂交瘤技术建立了稳定分泌抗rHu-IFN-α_1的单克隆抗体细胞系,体外连续传代8个月以上,在BALB/c鼠体内连续传代6个月以上,分泌抗体能力不变,特异性专一。11D_2单抗为IgG_2b,17D_9单抗为IgG_1。采用不同方法提纯抗体均得到90％纯度。11D_2单抗中和效价为1024,17D_9单抗为65534。制备亲和层析柱的最佳抗体浓度为5mg/ml,凝胶与抗体体积比为1:2,偶联率均达到95％～98％。11D_2单抗亲和层析柱提纯粗制rHu-IFN-α_1干扰素不易被洗脱,不适宜制备亲和层析柱。17D_9单抗亲和层析柱提纯粗制rHu-IFN-α_1结合的抗原容易被洗脱,适宜制备亲和层析柱。粗制rHu-IFN-α_1经17D_9单抗层析柱后,获得了电泳纯级制品,比原纯度增加15倍,平均收率93％,比活性平均值为6.5×10~6IU/mg。残余鼠IgG量符合规程要求。     

重组人干扰素α1b含片对大鼠免疫功能的调节作用

目的探讨重组人干扰素α1b(recombinant human interferonα1b,rhIFNα1b)含片对大鼠免疫功能的调节作用。方法将大鼠按体重随机分为模型组(空白基质片干粉)、阳性对照组(匹多莫德)及rhIFNα1b含片低(1 000 IU/片)、中(10 000 IU/片)、高(50 000 IU/片)剂量组,每组14只,给予相应药物,每日1次,连续给药3周,于首次给药第7、9天经腹腔注射环磷酰胺,60 mg/kg,同时设正常对照组(10只),末次给药8 h后开始禁食,24 h后称量大鼠体重,计算胸腺及脾脏系数,检测血清及脾脏细胞中白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IFNα水平,同时检测血清、唾液中IgG及IgA水平。结果与正常对照组比较,模型组大鼠体重及胸腺系数均明显降低(P 0. 05),血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFNα、IgG及IgA水平均明显下降(P 0. 01),脾脏中IL-4、TNF-α及IFNα水平均明显下降(P 0. 01),唾液中IgG及IgA水平均明显下降(P 0.01)。与模型组比较,各剂量rhIFNα1b含片组大鼠的体重、胸腺及脾脏系数差异均无统计学意义(P 0. 05);血清及脾脏中IL-2、IL-4、TNF-α及IFNα水平有不同程度的升高;血液及唾液中IgA水平明显升高(P 0. 05)。结论中、高剂量的rhIFNα1b含片对大鼠免疫功能具有明显的改善作用。     

聚乙二醇化重组人干扰素α2b的质量检测

目的　建立聚乙二醇化重组人干扰素α2b(PEG rhIFNα2b)的质量检测方法。方法　采用Wish细胞 VSV病毒系统 ,以CPE法测定干扰素的生物学活性 ,基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,反向高效液相法 (RP HPLC)测定纯度 ,溴化氰裂解 SDS PAGE法测定肽图 ,等电聚焦电泳法测定等电点 ,紫外分光光度法测定紫外吸收光谱。结果　聚乙二醇化重组人干扰素α2b的比活为 6 . 0× 10 6～ 10 . 0× 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量约为 6 2 6 0 0 ,等电点在 5 . 2 0～ 6. 5 5之间 ,紫外最大吸收峰约在 2 78nm波长处。结论　所建立的检测方法可控制聚乙二醇化重组人干扰素α2b质量。     

超声破碎重组大肠杆菌释放包含体的过程研究

重组人白细胞介素 (rhIL - 6 )基因表达产物在大肠杆菌的细胞浆中以包含体的形式存在。用超声破碎法提取rhIL - 6包含体系统研究了该过程中的物理和化学因素 ,包括破碎时间 ,输出功率 ,菌体浓度 ,缓冲液pH值 ,菌体冻融及悬浮液体系等。得到了破碎提取包含体的最适条件为 :超声功率 4 80W ,菌体浓度为 1 0 0g L左右。在去离子水中经过 1 5min超声破碎 ,表达量为 2 0 %的菌体可获得包含体的含量为 4 0 %(质量分数 ,下同 )     

重组人白细胞介素-6包含体溶解工艺研究

本文系统研究了影响大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 6 (rhIL 6 )包含体溶解的因素 ,确定了rhIL 6包含体溶解的最佳工艺条件 ,即在 pH为 8 4的 5 0mmol/LTris HCL缓冲体系中 ,变性剂尿素和还原剂 β 基乙醇 (β ME)的浓度分别为 8mol/L和 5 0mol/L ,包含体含量为 1 0mg/mL ,在 4℃下溶解 1h。包含体溶解后蛋白含量可达到 1 3mg/mL左右 ,目标蛋白的溶解率达到 98% ,纯度为 5 0 %左右     

HIV-1 Vif与ElonginC蛋白在大肠杆菌中的共表达

目的在大肠杆菌中共表达HIV-1Vif与ElonginC蛋白。方法PCR扩增ElonginC基因全长DNA片段,克隆入pMDT-easy载体,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切后,与质粒pRSETB连接,构建质粒pRSETB-ElonginC。将质粒pMRI-Vif转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株,再将此菌株制备成感受态细胞,用pRSETB-ElonginC质粒转化该细胞,经1mmol/L IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果质粒pRSETB-ElonginC经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切,可切出约3000和400bp的2条片段,测序证明质粒构建正确。在大肠杆菌中共表达了Vif与ElonginC蛋白,该蛋白具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中共表达了Vif与ElonginC蛋白。     

百日咳毒素S1亚基片段在大肠杆菌中的表达

目的构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成一个新的基因序列S1′。将该序列与7ZTS表达载体连接,构建重组原核表达质粒7ZTS-S1′,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果S1′基因经PCR鉴定及测序证明与预期相符;重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达蛋白的相对分子质量约17400,表达量约占菌体总蛋白的8%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建百日咳毒素S1亚基片段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为PT单抗及其检测试剂盒的研制奠定了基础。     

α1-酸性糖蛋白单克隆抗体的制备及检测方法的建立

目的制备α1-酸性糖蛋白(α1-Acid glycoprotein,α1-AGP)单克隆抗体(McAb),建立α1-AGP的ELISA检测方法,用于检测人体血液、尿液及各种组织液中α1-AGP的水平。方法用高氯酸沉淀人血清中α1-AGP,经离子交换层析和高压液相层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,建立特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备并鉴定McAbs,分析各株分泌抗体的效价、特异性、位阻群、类及亚类。制备针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA检测试剂盒,分析其稳定性、灵敏度和特异性,并进行临床评价。结果建立了9株特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,所有抗体的轻链均为κ链。根据位阻分析结果,将9个细胞株分泌的抗体分为5个位阻群,腹水效价在1×10-4~1×10-7之间,且均有较好特异性。制备的α1-AGP双抗体夹心ELISA试剂盒灵敏度达2ng/ml,且检测结果与α1-AGP含量呈现良好的线性关系(r=0.9916),并与其他血清蛋白无交叉反应,试剂盒置37℃放置3d及4℃放置2个月,稳定性良好。用该试剂盒检测96份正常人血样,其α1-AGP平均值为0.43~1.32mg/ml;105份Ⅱ型糖尿病患者血样,其平均值为0.88~2.35mg/ml,经统计学分析,两者差异有显著意义。结论已成功制备出α1-AGP McAb,并建立了针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA,制备的试剂盒可用于临床检测。     

大肠杆菌重组人成骨蛋白-1的非诱导表达特性

目的　研究大肠杆菌重组人成骨蛋白 1的非诱导表达特性。方法　通过水质、起始pH、接种量、葡萄糖添加量、甘油添加量、装液量、转速等实验研究不同营养条件和培养条件对OP 1非诱导表达的影响。通过传代实验 ,考察该系统OP 1表达的稳定性。结果　水质对OP 1的表达没有明显影响 ,2 %～ 4 %的接种量有利于OP 1的表达 ,起始pH以 6 0为宜。葡萄糖对OP 1的表达有较大影响 ,2 %～ 4 %的葡萄糖添加量可以获得较高表达。甘油的添加能明显促进OP 1的表达 ,最适添加量为 0 3% ,较对照提高表达 81 7%。该表达系统对溶氧的需求不大 ,装液量和转速分别以 12 5～ 15 0ml和 15 0r min为宜。在优化条件下 ,最适表达时间为 2 4～ 2 6h ,OP 1的表达量可达到菌体蛋白的 4 0 %。优化的营养条件和培养条件对本系统OP 1的表达和质粒的稳定有利 ,10次传代可保持 90 %表达。结论　建立了非诱导表达的摇瓶发酵工艺 ,对其非诱导表达特性有了较为深入的了解 ,为进一步放大研究奠定了基础。     

高效液相色谱法测定某能量饮料中七种水溶性维生素的研究

报道了利用反相液相色谱法测定某能量饮料中七种水溶性维生素(维生素C、PP、B5、B6、B1、B2、叶酸).样品利用Supelco C18(500mg)固相萃取柱萃取后,直接注入高效液相色谱柱Phenominex C-18(250 mm×4.6 mm),采用等度洗脱,流动相为0.1 mol/LKH2PO4(pH=7.0)-甲醇(体积比90∶10),流速为0.5 mL/min.各个化合物的保留时间以及UV谱图与标准谱图的对比可以指认各化合物.该方法的检测限为0.05～0.2 mg/L,平均回收率为94.71%～97.03%.     

重组人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达及生物学活性分析

目的在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10),并检测其生物学活性。方法将IL-10基因重组到质粒pET11c中,转化BL21(DE),提取质粒,经酶切鉴定和测序分析;在25℃用低浓度的IPTG诱导表达,对包涵体IL-10稀释复性;经ELISA检测其含量,MC/9细胞增殖法检测其生物学活性。结果工程菌IL-10/pET11c/BL21诱导表达的目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,Westernblot鉴定证实为IL-10蛋白,两种形式的IL-10均具有一定的生物学活性。结论已成功地在大肠杆菌中表达了IL-10,为进一步纯化和制备IL-10的基因工程药物打下了基础。     

A sandwich-type assay based on quantum dot/aptamer bioconjugates for analysis of E. Coli O157:H7 in microtiter plate format

An optical assay based on CdSe/ZnS quantum dots (QD)/NH₂-Apt bioconjugates for the pathogen detection was presented. QDs with carboxyl functional groups and 72-mer aptamer (against E. coli outer membrane proteins) were used as probes and sensing element. E. coli O157:H7 was selected as a model pathogen and 96-well plate assay in the sandwich hybridization format was constructed. Poly-L-lysine-coated 96-well plate surfaces were used as support material where thiol functionalized aptamers were immobilized by 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-SMCC). After incubation with the bacteria, CdSe/ZnS QDs/aptamer bioconjugates were added. The fluorescence signals were followed before and after addition of bioconjugates. Probe concentrations, incubation time with E. coli O157:H7 were also optimized. The bioassay could detect the pathogen down to 10² CFU/mL with high selectivity. The detection system was successfully employed in samples, in the presence of interfering compounds.     

重组人成骨蛋白-1基因在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达

目的　研究重组人成骨蛋白 -1(rhOP -1)在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达。方法　利用RT -PCR技术 ,从正常胎儿肾组织总cDNA中扩增得到rhOP- 1成熟肽基因片段 ,再将rhOP- 1成熟肽基因克隆于原核融合表达载体pGEX- 4T- 2中 ,构建表达质粒pCCBC- OP- 1,并转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)中 ,在发酵过程中不添加任何诱导剂。表达产物经SDS -PAGE分析。结果　扩增的目的基因序列与文献报道一致。表达的目的蛋白相对分子质量为 14 0 0 0 ,表达量达到菌体蛋白的 4 0 %。结论　克隆了人OP -1成熟肽基因 ,并实现了rhOP- 1的非诱导高效表达。