烟草18S rDNA染色体原位杂交技术优化研究

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）在细胞遗传学中有较多应用,其中重复序列常被作为探针来研究物种进化、分类。但现常用的探针序列均较长（200 bp-500 bp）,杂交耗时较多。本研究以烟草（Nictiana tabacum）为材料,克隆并标记18S rDNA保守序列（254 bp）,以其为探针对烟草染色体进行FISH,经18 h杂交获得了清晰的信号。在此基础上,利用荧光素直接标记引物序列（寡聚核苷酸）,经较短时间（2 h）的杂交,也获得了清晰的信号。以寡聚核苷酸为探针对云烟87四倍体、N.tabacum-N.plumbaginifolia五倍体、烟草六倍体、云烟87八倍体以及N.plumbaginifolia的染色体进行杂交,均获得了良好效果。且杂交液可简化配制,洗脱过程也可简化。18S rDNA寡聚核苷酸探针与5S rDNA寡聚核苷酸探针结合,实现了N.plumbaginifolia的18S rDNA和5S rDNA双色FISH。所以,该寡聚核苷酸序列可以应用于烟草属植物18S rDNA（45S rDNA）位点的分析,且较大程度缩短了操作时间并简化了操作过程。      

芦笋18S rDNA序列和分类分析

通过植物基因组提取方法对芦笋的基因组DNA进行提取,采用PCR方法对其18S rDNA片段进行扩增,再经连接、转化、筛选后,获得长度为1684bp的18S rDNA序列。将序列提交后,获得GenBank数据库基因登录号GU217543。分析芦笋18S rDNA的基因序列,确定芦笋与百合目(Liliales)和天门冬目(Asparagales)的多种植物在分类上有很近的关系,从而对分子水平上芦笋的分类有了进一步的了解。     

印度谷螟18S rDNA的克隆及定量PCR方法的建立

为挖掘储粮害虫印度谷螟的基因信息,开发用于生物系统进化研究的工具,建立基因表达水平的研究方法,本文利用分子生物学方法从印度谷螟幼虫体内克隆获得了18S rDNA 的基因全长序列（1888 bp,GenBank登录号为KJ836335）。利用邻位连接法（neighbor-joining）分别构建了基于18S rDNA 基因全长、保守序列II以及多变区的系统发育树,比较了与其他已知昆虫18S rDNA基因的同源性和遗传距离。与其它序列的系统发育树相比,其全长序列的系统发育树更能反映鳞翅目昆虫的亲缘关系,印度谷螟与大蜡螟的亲缘关系最近。此外,建立了以18S rDNA为内参基因的实时荧光定量PCR方法。     

具翼烟草(Nicotiana alata)核型、C带与rDNA染色体定位研究

采用去壁低渗法、BSG法和双色荧光原位杂交技术,分别开展了具翼烟草（Nicotiana alata）的核型分析、C显带与45S和5S rDNA染色体定位研究。4个具翼烟草收集系根尖细胞有丝分裂中期染色体平均核型为2n=2x=12m+6st,染色体臂比的变异幅度为1.14~4.22,平均臂比值为2.17,最长与最短染色体之比为2.16,属2B型。C带研究结果显示,具翼烟草中期染色体C带丰富,多态性良好,共显带25条,包括7条着丝粒带、15条端带和3条中间带。45S和5S rDNA染色体定位研究结果显示,具翼烟草根尖细胞有丝分裂中期染色体细胞相分别显示了3对45S rDNA和2对5S rDNA基因位点信号,45S rDNA基因位点分别位于I S、III S、V L上,2对5S rDNA基因位点分别位于I L、IV S上（字母L和S分别代表染色体长臂和短臂,罗马数字代表同源染色体序号）。在I号同源染色体上同时存在45S和5S rDNA基因位点。研究结果对烟草属系统起源、遗传进化以及遗传育种等领域的进一步研究具有重要的参考价值。      

16S rDNA PCR-RFLP分析鉴定开菲尔发酵剂中的乳酸菌

对传统乳制品开菲尔发酵剂通过菌种分离和纯化得到67 株乳酸菌,经过传统形态学分类区分成6 种形态类型。在此基础上进行16S rDNA限制性片段长度多态性聚合酶链反应（polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP）分析法鉴定为4 种分子类型,分别为：乳明串株菌（L. lactis）、坚强肠球菌（E. durans）、意大利肠球菌（E. italicus）、嗜热链球菌（S. thermophilus）。其中坚强肠球菌菌数超过50%,占所分离菌株的62.7%,为优势菌。     

熟制鲍鱼残留细菌的分离及16S rDNA鉴定

为控制熟制鲍鱼残留的细菌污染,采用平板划线分离技术对烘制加工后鲍鱼中残留的主要菌群进行分离,并通过菌落形态观察、革兰氏染色分析和16S rDNA 序列比对等方法对其进行鉴定. 结果表明,残留在烘制加工后鲍鱼的主要菌群有希瓦氏菌属、不动杆菌属、库特氏杆菌属、海洋类香菌、蜡样芽孢杆菌、肠杆菌属、彭氏变形杆菌等.     

应用16S rDNA分析撒坝火腿表面和内部微生物多样性

为分析云南撒坝火腿中微生物的菌群构成、物种丰富度和多样性差异,以1年以上的撒坝火腿为研究对象,通过提取DNA,采用Illumina高通量测序方法对火腿表面和内部细菌的16S rDNA V3～V4区和真菌ITS2区进行扩增和测序,并对其菌落构成和多样性进行分析。结果表明:撒坝火腿中微生物菌群存在差异,细菌丰富度极显著高于真菌(P<0.01),多样性高于真菌,且内部真菌和细菌微生物多样性和丰富度均高于表面;子囊菌门下曲霉菌属是表面和内部真菌中的优势菌群,其次Yamadazyma和青霉菌属也是主要菌群,这些菌属在火腿表面的分布多于内部;厚壁菌门下葡萄球菌属是火腿表面和内部细菌中的优势菌群,色盐杆菌、酸杆菌和链球菌也是表面的主要菌群;放线菌、杆菌属、酸微菌纲及球菌属则是火腿内部的主要菌群,此外火腿内部还存在大量未知微生物。综上所述,曲霉菌和葡萄球菌是撒坝火腿表面和内部的优势菌群。     

保温发酵鱼露中细菌群落的16S rDNA分子生态分析

本文通过对细菌16S rDNA V₄区进行高通量测序,并结合实时荧光定量PCR 法(FQ-PCR)研究35 ℃发酵条件下鱼露的细菌群落多样性。研究发现发酵初期细菌数量快速下降,到后期数量基本保持稳定。鱼露中细菌群落组成复杂,在测序得到的所有细菌OTUs中共注释出37个门、238个属,但有50%左右的OTUs未能注释到属。发酵8个月后,继续增加发酵时间,鱼露中的细菌组成变化不明显。在门的水平上,在鱼露发酵的各个阶段中细菌主要分布在变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes);在属分类的水平上,优势菌主要有乳杆菌属(Lactobacillus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、不动菌属(Acinetobacter)等。发酵前2个月,优势菌是嗜冷杆菌属(Psychrobacter,23.39%)、链球菌属(Streptococcus,5.34%)、乳杆菌属(Lactobacillus,3.05%),发酵12个月时,主要优势菌中变形菌门中以链球菌属(Streptococcus,3.62%)、乳杆菌属(Lactobacillus,3.23%)、葡萄球菌属(Staphylococcus,1.20%)为主,而厚壁菌门以不动菌属(Acinetobacter,9.14%)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter,8.77%)、假单胞菌属(Pseudomonas,6.78%)为主,其中耐盐和嗜盐的乳酸菌主要有乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)等。     

浓香型白酒糟醅中可培养酵母18S rDNA全序列的系统学分析

从发酵7d的浓香型白酒发酵酒酷中分离到84株酵母菌,通过形态特征、生理特性检测及18SrDNA分子生物学水平鉴定方法将其归为6个类群,并建立系统发育树。结果表明,样品酒醅中可培养酵母以伊萨酵母属（Issatchenkia）和毕赤酵母属（Pichia）为主,得巴利酵母属（Debaryomyces）和假丝酵母属（Candida）占有相当的比例,其中还有一定数量的其他属种如酵母属（Saccharomyces）和红酵母属（Rhodotorula）。     

利用16S rDNA序列及tuf-RFLP鉴定蒙古国发酵乳中的乳酸菌

运用16S rDNA序列分析和tuf-RFLP技术对采于蒙古国扎布汗省的25份发酵乳样中分离出的110株乳酸菌进行鉴定。首先将分离的110株乳酸菌的16S rRNA基因进行扩增,测序并构建系统发育树,初步鉴定为41株嗜热链球菌,40株瑞士乳杆菌,11株德氏乳杆菌保加利亚亚种,2株发酵乳杆菌,1株乳明串珠菌,2株肠膜明串肠膜亚种,1株乳酸乳球乳酸亚种和12株属于干酪族的菌株。由于干酪乳杆菌族的16S rDNA序列差异很小,故采用tuf-RFLP技术对这12株进行了进一步的验证,通过分离菌株与模式菌株tuf-RFLP图谱的比较分析,结果表明这12株菌均为干酪乳杆菌。     

基于16S rDNA高通量测序分析水牛初乳与常乳中细菌多样性

目的:利用16S rDNA高通量测序研究广西水牛研究所种畜厂三品杂水牛初乳与常乳的细菌多样性.方法:提取当天采集的生水牛乳样本的细菌总DNA,PCR扩增其16S rDNA,利用纯化后的扩增片段构建其菌群的16S rDNA文库,采用Miseq PE300平台进行高通量测序以及BLAST比对.结果:初乳组样本共得到19个门...     

酒醅中芽孢杆属细菌的16S rDNA全序列系统学分析

从浓香型白酒窖池酒醅中分离到69株芽孢杆菌,通过形态特征和生理特性检测等传统鉴定方法,将其归为5个类群。用聚合酶链反应（PCR）扩增出5个类群代表菌株的16SrDNA基因全序列,并对其进行测序。用blast软件在Genbank中进行所得序列的同源性检索,并构建系统发育树。从系统发育树可以看出,样品中芽孢杆菌以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为主,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）也占有相当的比例,还有一定数量的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereuso表明窖池酒醅中芽孢杆菌呈现多样性,且优势种群不明显。     

基于16S rDNA高通量测序技术分析北京豆汁儿微生物多样性和功能预测的研究

以北京不同城区具代表性的6家豆汁儿店的豆汁儿为研究对象,采用16S rDNA测序分析对豆汁儿中所含优势菌进行研究。结果表明:乳杆菌属(Lactobacillus)是豆汁儿中的优势菌属,乳杆菌目(Lactobacillales)占比达到95.8%以上。优势菌种为食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、沙克乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)。对豆汁儿中乳杆菌目(Lactobacillales)进行功能预测分析,推测豆汁儿中的风味物质来源于氨基酸代谢,发酵过程中产生β-低聚半乳糖及GOS,益于肠道菌群健康。     

哈尔滨风干肠中优势蛋白质降解菌筛选及16S rDNA鉴定

以哈尔滨风干肠中41株球菌为对象,进行降解蛋白质酶活力的研究。采用定性和定量两种方法,筛选具有降解蛋白质酶活力的菌株,并对筛选出的菌株通过提取其DNA,进行PCR扩增,16S rDNA序列测定,进行系统的分类鉴定。结果表明:41株菌中只有10株菌具有降解蛋白质酶活性,其中CHMS34.1、CHMS34.3、CHMS34.9、CHMS34.15,4株具有较高的降解蛋白质酶活力,其酶活力分别为282、312、310、305U。4株解蛋白质菌的16S rDNA序列与GenBank中的已知序列相似性很高,确定了CHMS34.1、CHMS34.15为Staphylo-coccus pasteuri种菌株,CHMS34.3为Staphylococcus simiae种菌株,CHMS34.9为Staphylococcus xylosus种菌株。     

一株新的海洋放线菌所产黄色素稳定性研究及其16S rDNA序列分析

对一株分离自威海海域的产黄色素的海洋放线菌新菌株MA01进行了色素提取方法及其稳定性的研究。测定其最大吸收波长,考察了pH、光照、温度、金属离子、氧化剂和还原剂、防腐剂等因素对黄色素稳定性的影响。此外,对菌株MA01进行分子鉴定,利用PCR技术扩增其16S rDNA序列,并构建了系统进化树。实验结果表明,该黄色素在300nm处有最大吸收峰,超声波法提取色素优于溶剂法。该黄色素为水溶性色素,易溶于甲醇和乙醇,在弱酸性、中性和碱性条件下稳定,温度小于60℃时热稳定性良好,对紫外光和可见光照射稳定性良好,基本不受金属离子K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Ca2+影响,防腐剂食盐和蔗糖对其均无不良影响。该黄色素不耐氧化剂,还原剂也会降低其稳定性。16S rDNA序列分析和系统进化树显示菌株MA01与多株Streptomyces sp.的16S rDNA具有99%的相似性,初步鉴定菌株MA01是链霉菌属Streptomyces sp.的一种。菌株MA01具有较高的研究和开发价值。      

应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳和 16S rDNA技术分析果冻胀气原因

目的分析某品牌果冻胀气的原因。方法提取胀气果冻总DNA,采用聚合酶链式反应-变性度凝胶电泳技术(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)进行菌群结构分析,同时采用平板分离法从果冻中分离细菌。并将分离得到的菌株进行16S rDNA扩增和测序比对分析。将分离的菌株接种到正常果冻中进行产气实验。结果 PCR-DGGE和平板分离结果表明,在胀气果冻中分别只检测到一种细菌,未检测出真菌。测序比对结果表明该细菌属于芽孢乳杆菌属。将该菌接种到正常果冻中会引起果冻胀气。结论芽孢乳杆菌是导致该品牌果冻胀气的主要因素。     

不同发酵温度下虾油中细菌的16S rDNA分子生态分析以及蛋白酶系和产品品质的变化研究

本文采用16S r DNA高通量测序技术分析了不同温度发酵下虾油菌相的变化,采用酶谱电泳研究了虾油蛋白酶系的变化,并结合测定各质量指标以探索细菌在虾油发酵中的作用。研究发现虾油中细菌数量远高于真菌数量,显示了细菌对发酵的重要贡献。虾油菌相复杂,且不同温度下菌相差异很大;发酵中菌相及蛋白酶系均呈现动态变化,25℃和35℃发酵的虾油中蛋白酶失活较少,且存在大量Tetragenococcus,Virgibacillus等产生良好风味成分的细菌;而45℃的虾油中蛋白酶失活严重,且检出的细菌与产生良好风味无关,感官评定也最差,因此,45℃不适合发酵虾油。发酵30 d时,虾油中的氨基酸态氮、无盐可溶性固形物、挥发性盐基氮(TVB-N)和三甲胺(TMA)等均达到峰值,此后各指标基本恒定,但菌相仍变化较大且有1种新蛋白酶出现,而且虾油风味继续改善。     

发酵肠中一株细菌的16S rDNA鉴定及抗菌肽Surfactin对其芽孢灭活的效果

经过杀菌的发酵肠,仍有部分会变质,为探究其原因并进行控制而进行了以下试验。从商业发酵肠中分离获得1株耐热芽孢菌株B1,为构建控制技术,提高发酵肠安全水平,对该芽孢菌进行鉴定,并研究抗菌肽surfactin对其芽孢生长曲线的影响及盐类对surfactin灭活芽孢效果的影响。采用16S rDNA序列分析对该菌进行鉴定,并研究了不同浓度的NaCl和Na2HPO4?12H2O对surfactin灭活芽孢效果的影响。结果表明,该菌属蜡样芽孢杆菌属,同源性相似度达99%,仅有surfactin对芽孢作用时,不同浓度（20、25、30、35 μg/mL）的surfactin对其芽孢没有显著的杀灭作用,与NaCl和Na2HPO4?12H2O协同作用时,3%、5%、9%的NaCl可配合50 μg/mL和100 μg/mL的surfactin可有效杀灭芽孢,Na2HPO4?12H2O无此效果。该菌属于蜡样芽孢杆菌属,NaCl与surfactin共同作用可有效杀灭蜡样芽孢杆菌的芽孢,Na2HPO4?12H2O无显著作用。     

创伤弧菌16S-23S rDNA间区变形梯度凝胶电泳多态性分析

目的 建立创伤弧菌基因分型的新方法,了解创伤弧菌的分子特征.方法 应用PCR-变形梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对创伤弧菌的16S-23S rDNA间区(16S-23S rDNA intergenic spacer regions,ISR)多态性进行分析比较,结合药敏试验,以进一步验证分离菌株之间的亲缘关系.结果 ISR-PCR将创伤弧菌菌株扩增出4条约900、750、650、550 bp大小不同的条带;同时,创伤弧菌的ISR-DGGE序列表现出明显的株间差异,18株共产生了16种不同的指纹图谱;聚类分析将所有的细菌分为两大类,相似性分别为0.65和0.71;亲缘关系较近的菌株具有不同于关系较远的菌株的耐药谱,与ISR-DGGE指纹图谱分析相一致.结论 这种分子操作技术完全能够用于创伤弧菌株型的调查与鉴定,为创伤弧菌的基因分型提供了一种新的方法.     

Pycnoporus sp. SYBC-L1 18S rDNA序列分析及其固态发酵水葫芦产漆酶的研究

从朽木上筛选到一株产漆酶的白腐真菌SYBC-L1,该菌株在PDA-Guaiacol培养基上显红色,通过18S rDNA序列测定和进化树聚类分析,表明其属于密孔菌属,命名为Pycnoporus sp. SYBC-L1。以水葫芦为基本培养基质,以漆酶活力为指标,对其产酶培养基进行了初步优化,得其适宜的培养基为:水葫芦12.5%,可溶性淀粉与豆粕质量比1∶1,起始含水量65%,Cu2+浓度1.5mmol/L,没食子酸20μmol/L,30℃,培养9d,漆酶活力可达19.17U/g,为优化前的8.75倍。Pycnoporus sp. SYBC-L1漆酶提取的适宜条件为:20mmol/L,pH6.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液,浸提3h。