普通烟草钙依赖蛋白激酶NtCDPK15的基因克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)对Ca²⁺信号转导通路下游元件的调控具有重要作用。本实验采用同源克隆技术从普通烟草中分离得到1 个CDPK 基因,命名为NtCDPK15(GenBank 登录号为JN662020),cDNA 全长为1963 bp,ORF 大小为1569 bp,编码522 个氨基酸。多序列比对结果表明,NtCDPK15 的编码产物具有典型的CDPK 保守序列,C 末端调控区有4个EF 手性结构。系统进化树分析显示,NtCDPK15 可能来源于绒毛状烟草,预测NtCDPK15 与NtCDPK1这对旁系同源基因在功能上可能非常保守。实时荧光定量PCR 分析结果表明,NtCDPK15 在根和叶中的表达量显著高于茎中的表达量,但经盐胁迫诱导后NtCDPK15 在茎中的表达量显著增加,同时,盐胁迫还使基因在叶中的表达量显著上调,ABA 胁迫可诱导基因在根中的表达,而干旱胁迫可使基因在根和叶中的表达量下调,这些结果说明NtCDPK15 在普通烟草中的表达受盐胁迫及ABA 胁迫诱导,但受干旱胁迫抑制。     

烟草过氧化氢酶基因CAT2克隆与表达特征分析

基于已有的植物Catalase 2基因（CAT2）序列设计烟草Nicotiana tabacum CAT2的特异性引物,通过RT-PCR扩增克隆获得Nicotiana tabacum var.NC89 CAT2全长mRNA序列,包含1479 bp完整的读码框（ORF）,可编码492个氨基酸残基。遗传进化分析显示,烟草NC89 CAT2与N.benthamiana CAT2基因亲缘关系最近。利用Quantitative Real-time PCR技术分析了CAT2基因在NC89烟草中的组织特异性表达和其应对生物和非生物胁迫的表达差异。结果表明,CAT2基因在烟草NC89的根、茎、叶、花瓣、花萼、种子中均有表达,其中在花中相对表达量最高,其次为叶、茎、种子和根。生物和非生物胁迫处理烟株,其CAT2诱导表达分析显示,机械损伤、渗透压、低温和高温、干旱和感染PVY时CAT2表达量均上调。上述研究表明烟草CAT2基因可能参与了应对非生物和生物胁迫的过程。     

烟草E3泛素连接酶NtHOS1a和NtHOS1b基因的克隆与表达分析

为明确与烟草低温早花有关的调控基因,利用生物信息学方法结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆了2个E3泛素蛋白连接酶HOS1基因cDNA全长序列,分别命名为NtHOS1a(Gen Bank登录号:KU558689)和NtHOS1b(Gen Bank登录号:KU558690)。NtHOS1a基因全长为3 599 bp,编码963个氨基酸;NtHOS1b基因全长为3 578 bp,编码954个氨基酸;两基因氨基酸序列的一致性为95%,与拟南芥HOS1蛋白(NP_181511)的序列一致性分别为51%和50%。两基因编码蛋白的N末端均含有一个E3泛素连接酶特征的环指结构域。荧光定量PCR分析表明:在正常生长条件下,NtHOS1a和NtHOS1b在烟草根、茎、叶中表达强烈,12℃低温处理10 d后两基因在烟草根、茎、叶中的表达量均有不同程度的降低,说明在烟草根、茎、叶组织中NtHOS1a和NtHOS1b的表达量受低温胁迫的负向调控。     

烟草过氧化氢酶基因CAT1的克隆及表达特征分析

基于GeneBank中已有的植物Catalase 1（CAT1）基因序列设计烟草CAT1的特异性引物,通过RT-PCR扩增克隆获得Nicotiana tabacum var. NC89 CAT1全长mRNA序列,可编码492个氨基酸残基。遗传进化分析显示NC89 CAT1中与N .benthamiana CAT1基因亲缘关系最近。利用real-time RT-PCR技术对CAT1基因在烟草中的组织表达特异性和烟草NC89应对生物和非生物胁迫的表达差异进行了分析。结果表明CAT1基因在烟草NC89的根、茎、叶、花瓣、花萼、种子中均有表达,其中在根部表达量最低,在叶中相对表达量最高。生物和非生物胁迫处理烟株,其CAT1诱导表达分析显示,机械损伤、渗透压、低温和高温、干旱、和感染TMV CAT1表达量上调,紫外胁迫下表达量下调。上述研究表明烟草CAT1基因可能参与了植物的生长发育、应对非生物和生物胁迫的过程。      

烟草Nt14-3-3基因的克隆及生物信息学和表达模式分析

为明确烟草中Nt14-3-3基因家族的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个14-3-3蛋白基因Nt14-3-3,并进行了生物信息学分析。运用qRT-PCR技术,对该基因非生物胁迫处理烟草幼苗后的表达特性进行了分析。结果显示,该基因序列全长783 bp,编码260个氨基酸残基。Nt14-3-3蛋白是由9个α螺旋组成的球状蛋白,含有32个磷酸化位点。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。Nt14-3-3基因受低钾、高盐、干旱、脱落酸(ABA)、H_2O_2处理的诱导,表明烟草Nt14-3-3基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

普通烟草抗渗透胁迫基因NtP5CS的克隆与表达分析

从普通烟草中克隆脯氨酸合成的关键酶基因P5CS,分析其序列特征、进化关系、表达模式,以期为烟草的抗逆研究奠定基础。设计兼并引物获得P5CS基因中间片段,利用RACE技术扩增其全长cDNA;采用生物信息学技术分析该基因的序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用RT-PCR研究其表达模式。从受干旱胁迫诱导的普通烟草品种中烟14中克隆到全长为2584bp的烟草P5CS基因,命名为NtP5CS,GenBank登录号为HM854026,开放读码框为2160 bp,编码719个氨基酸。经Blast同源性比对分析,该序列与番茄tomPRO2基因在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。系统进化树分析显示,NtP5CS与番茄tomPRO2基因可能是直系同源基因。RT-PCR分析表明,干旱、低温、ABA、高盐等胁迫条件均可诱导NtP5CS基因的上调表达,且在旺长期和胁迫条件下根和叶中表达量最高。首次从普通烟草中克隆得到P5CS基因,该基因对水分胁迫响应,可能参与普通烟草抗渗透胁迫反应。     

烟草NtSAP5基因克隆及干旱胁迫下的功能鉴定

为研究烟草对干旱胁迫的响应机制,克隆了烟草中锌指蛋白基因NtSAP5并对其在干旱胁迫下的表达量进行了检测。结果表明,该基因全长CDS序列为474 bp,编码的蛋白中含有保守的锌指蛋白结构域,该基因NtSAP5的表达受干旱胁迫调控,在干旱胁迫下表达量先升高,后缓慢降低。将NtSAP5的CDS序列克隆到植物过表达载体pG2BW7中,并通过叶盘法转入烟草K326中进行干旱胁迫下的功能验证。选取两个独立的转基因株系及非转基因植株进行干旱胁迫处理,过表达NtSAP5的转基因植株比非转基因植株具有较强的抵御干旱胁迫能力。结果表明,烟草NtSPA5响应干旱胁迫,并在干旱胁迫应答中起到作用。      

花生中UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆及在非生物胁迫下的表达研究

通过RACE技术从花生叶片cDNA中克隆到了UDP-葡萄糖基转移酶的基因,命名为AhUGT83A1-like（GenBank注册号为KF411463）。该基因全长为1 530bp,ORF为1 380bp,编码460个氨基酸。序列比对与进化分析结果表明,该序列有保守的UDPGT结构域,并且与其它植物的UGT蛋白同源性较高。荧光定量PCR结果表明,AhUGT83A1-like基因在高盐和低温处理的花生根和叶片中均上调表达;在干旱处理时,根中表达也受到显著上调,但叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhUGT83A1-like可能参与了花生对干旱、低温和高盐的抗性调控。ABA处理结果表明,AhUGT83A1-like在花生根中对ABA响应明显,但在叶片中对ABA没有明显响应,表明该基因在花生根中对非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式发挥作用的。     

普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析

NAC家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育以及应对环境胁迫中起着至关重要的作用，克隆和验证烟草中NAC相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究采用RT-PCR方法从普通烟草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，对NtNAC055及其编码蛋白进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位和转录激活等相关试验。结果发现，NtNAC055基因的CDS序列全长为1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC结构域，编码一个具有343个氨基酸的NAC转录因子；通过进化分析发现，烟草NtNAC055与拟南芥ANAC055同源性较高，同属于RD26亚家族；通过亚细胞定位分析以及转录激活分析发现，NtNAC055蛋白在细胞核中且具有转录激活活性；运用qRT-PCR技术，对该基因不同组织和胁迫处理后的表达进行了分析，结果显示，NtNAC055基因在根、茎、叶、花和腋芽中均有表达，且在根部表达量最高；同时，该基因受干旱和热胁迫的诱导，表明烟草NtNAC055基因可能参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

不同花生基因型对干旱胁迫的适应性

以北方花生产区推广种植的29个花生品种（系）为试材,在人工控水条件下,对中度土壤水分胁迫下的植株形态、生物质累积和光合色素含量等指标变化进行研究。结果表明,干旱胁迫下,不同品种主茎高和分枝数总体上降低,根冠比、光合色素含量和比叶面积增大,且随胁迫时间延长变化趋势明显,叶绿素a增加最为明显。不同花生品种对土壤水分胁迫程度和胁迫时间的反应不同,且品种间差异明显。此外,干旱胁迫造成的同一品种或品种间生物量积累分配、根/冠和比叶面积等性状的差异,在不同生长阶段并不完全一致。苗期各指标与品种（系）抗旱性间无显著相关关系;花针期各指标与抗旱性间相关关系显著,是花生干旱胁迫的敏感期。综合分析表明,花育17号、花育25号、唐科8号、丰花1号、鲁花14、冀花4号和花育27号具有较强的耐旱抗旱能力。     

土壤团聚体大小对大豆出苗和幼苗生长的影响

采用盆栽试验对生长在不同粒径团聚体干旱土壤中大豆出苗和幼苗生长指标进行研究。结果表明,在低土壤含水量条件下,与大粒径团聚体和未筛土壤相比,小粒径团聚体（尤其1～2mm）显著提高大豆出苗率（P〈0．05）,缩短出苗时间,显著增加冠干重、苗高及叶面积,显著增加总根长和根表面积,但显著降低主根直径和根干重（P〈O．05）。说明大粒径团聚体不利于干旱土壤大豆出苗和幼苗生长,种床内小粒径团聚体可部分地补偿土壤干旱对大豆出苗和幼苗生长造成的危害。     

水钾耦合对大豆光合特性及其产物积累运转的影响

盆栽条件下,研究了不同生育时期水钾耦合对大豆光合特性及水分利用效率的影响,并对光合速率与各器官干物重进行相关分析。结果表明：苗期与花期控水时,土壤水分及水钾互作极显著影响净光合速率（Pn）;结荚期控水时,水分极显著影响Pn。花期与荚期控水后测定的Pn要高于苗期的Pn。水钾耦合对光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）和气孔导度（Gs）的影响趋势相似,即水分效应要优于钾肥,且一般而言同一钾肥水平下,土壤水分的影响表现为：充足W4〉适宜W3、特涝W5〉略旱W2〉特旱W1。只有当土壤水分供应适宜（W3）时,钾肥的施用提高了植株的Pn、Tr和Gs。水分对植株水分利用效率（WUE）的影响要优于钾肥,且水分为正效应。苗期及开花期控水条件下,植株的Pn与根、茎、叶干物重呈极显著正相关（p〈0.01）,且Pn与各器官的相关程度表现为茎〉叶〉根;结荚期植株Pn与根、茎、叶干物重仍呈极显著正相关（p〈0.01）,与荚粒干物重呈显著正相关（p〈0.05）。     

烯效唑浸种对大豆苗期抗旱性的影响

为明确烯效唑对大豆苗期抗旱性的影响,以浙春3号为试材,采用不同浓度（0、0．05、0．1、0．2和0．4mg／kg）烯效唑浸种,探讨不同水分胁迫（正常供水、轻度胁迫和中度胁迫）下烯效唑对大豆苗期的抗旱效应。结果表明：烯效唑浸种降低了苗高,提高了大豆出苗率、茎粗和根冠比;同时还提高了叶片相对含水量、脯氨酸（Pro）含量和可溶性糖含量。烯效唑处理降低了丙二醛（MDA）含量,从而降低了脂质过氧化程度,提高了保护性酶的活性。正常供水下,SOD、POD和CAT酶活性均以0．1mg／kg处理最高,分别较对照提高了18．75％、8．43％和37．4％;轻度水分胁迫下,SOD、POD和CAT酶活性均以0．2mg／kg处理最高,分别较对照提高了23．53％、11．63％和47．5％;中度水分胁迫下,SOD、POD和CAT的酶活性均以0．4mg／kg处理最高,较对照分别提高了22．86％、11．2％和56．1％。可见,适宜浓度的烯效唑浸种可改善套作大豆苗期生长,提高抗旱能力。     

干旱胁迫对芝麻生长与产量性状的影响及其抗旱性综合评价

利用盆栽法在苗期和花期对5个芝麻品种进行10d的干旱胁迫处理,测定了苗期胁迫处理后17个生长相关性状指标和苗期、花期胁迫处理后的13个产量性状指标。结果表明：（1）苗期干旱胁迫处理使芝麻植株生长速率减缓,根系发育缓慢,叶片数量减少,叶片变小,株高变矮,生物量降低,严重影响芝麻的生长发育;（2）花期干旱胁迫处理后除千粒重之外的其他产量性状指标值均低于苗期处理,花期干旱胁迫对芝麻的影响大于苗期,苗期处理对芝麻株高、蒴果数和蒴果大小等性状影响较小,对千粒重和单株种子干重等影响较大,而花期处理对芝麻株高、蒴果大小、每蒴粒数、单株种子干重和根系干重等性状影响较大;（3）不同基因型品种间对干旱胁迫的反应存在较大差异;（4）利用主成分分析法和隶属函数法相结合通过43个单项指标抗旱系数对5个芝麻品种进行了综合评价,为芝麻抗旱性鉴定提供了参考方法,并认为苗期干旱胁迫及胁迫后的生长相关性状指标可以作为芝麻抗旱性鉴定的简单方法和抗旱性评价的简易指标;（5）获得黑芝09-1和金黄麻为抗旱性较强的芝麻品种。     

花生根系分泌物自毒作用研究

采用连续收集法提取花生植株的根系分泌物,就其对花生种子发芽、幼苗生长、细胞膜的过氧化、抗氧化酶系统的影响等进行了研究,旨在探讨花生是否存在自毒作用。结果表明,花生根系分泌物的中性、酸性和碱性组分显著抑制了胚根的生长（P〈0.01）,随添加浓度的增加抑制作用逐渐增强,其中,中性组分的抑制作用最强。经过20d的处理,3种组分对花生幼苗的生长均表现出显著的化感抑制作用（P〈0.05）,作用规律与对胚根的抑制作用相似,在中性组分最高添加浓度30 mg/L处理下,株高、地上部鲜重、根系鲜重分别为对照的80%、73%和66%。叶片中SOD和POD的活性显著提高（P〈0.01）,MDA的含量也显著增加（P〈0.001）。3种组分中中性组分的化感促进作用最强,其次是酸性组分,碱性组分的作用相对最弱。研究结果证明了花生根系分泌物自毒作用的存在,是导致花生连作障碍的原因之一。     

印度梨形孢真菌促进芝麻生长并提高芝麻抗旱性

将印度梨形孢（Piriformospora indica,Pi）真菌接种芝麻幼苗根部,分别在大田及温室条件下研究供试真菌对芝麻生长和抗旱性的效应。大田试验主要调查产量性状,温室试验在芝麻初花期进行15d的持续干旱处理,测定株高等形态性状、过氧化氢酶活性等生理指标。结果表明,接种及未接种只真菌的芝麻植株在干旱处理前后叶长、叶宽差异达到极显著水平,株高、全展叶片数、基部茎粗、叶绿素含量、根颈粗差异达到显著水平;在人工干旱胁迫条件下,接种尉真菌后芝麻植株能维持较高的过氧化氢酶（CAT）活性和较高含量的脯氨酸（Pro）,降低丙二醛（MDA）含量,从而减轻干旱胁迫伤害。在千粒重及单株籽粒重两个产量性状上,大田和温室接种的芝麻与未接种的差异均达到显著水平。接种成真菌不仅能促进芝麻的生长,而且在干旱条件下,使得芝麻表现出较强的抗旱性,显著提高芝麻产量。     

套作遮荫条件下烯效唑对大豆壮苗机理的研究

为探明烯效唑在套作遮荫条件下对大豆的壮苗机理,通过盆栽试验,研究了烯效唑干拌种（0、2、4、Stag／kg）对大豆苗期根、叶生理功能的影响。结果表明,烯效唑干拌种提高了根体积、根系活力和根系活跃吸收面积（除8mg／kg）,但显著降低了根长。同时,烯效唑干拌种还提高了根、叶中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性,从而降低了脂质过氧化程度,降低了根、叶中丙二醛（MDA）含量,提高了根、叶中脯氨酸（Pro）含量,最终保护了细胞膜的完整性和功能性,其中烯效唑干拌种浓度以4rag／ks最佳。可见,适宜浓度的烯效唑干拌种可以改善套作大豆苗期生长状况,提高耐荫抗逆能力,有利于套作大豆后期的营养生长和生殖生长。     

大豆品种抗旱性早期鉴定方法

为探讨鉴定大豆品种抗旱性的简易方法,依据吸水后48h的发芽率对109个大豆种质材料进行抗旱性分级。继而在萌发期、营养生长期（V3）和生殖生长期（R4）进行盆栽控水试验,根据抗旱等级验证大豆植株的抗旱性。结果发现,大豆品种间抗旱性存在显著差异。种子吸水量与抗旱性无关,吸水后48h发芽率与抗旱性密切相关。幼苗侧根数量、主根长度和根系干重与抗旱性呈显著（P〈0.05）相关。对萌发后幼苗供水24h后,随即停水24h,反复干旱处理,抗旱品种存活率显著高于普通品种。在V3期对盆栽植株进行暂时萎蔫（土壤含水量为9%～11%）的水分胁迫处理,发现停水后普通品种叶片首先发生萎蔫,且株高、茎直径及叶面积下降的程度均高于抗旱品种。水分胁迫下,抗旱品种株高、茎直径和叶片面积均显著（P〈0.05）高于普通品种,其中茎直径和叶片面积达到极显著水平（P〈0.01）。在R4期暂时萎蔫的水分胁迫下,抗旱品种根的生物量和分枝的生物量显著（P〈0.05）高于普通品种。鼓粒期（R6）普通品种发生永久萎蔫、植株死亡,而抗旱品种仍能保持生长能力。研究结果表明,大豆种子48h发芽率可作为大豆品种抗旱性的鉴定和筛选方法,鼓粒期大豆对水分胁迫最敏感。     

HD/GC-MS法测定辣木树不同部位挥发性香气成分的研究

采用水蒸汽蒸馏(HD)结合气相色谱-质谱(GC-MS)分析辣木叶、茎和根的挥发性香气成分,用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。辣木叶中共鉴定出43种化合物,主要成分为苯乙醛(14.52%)、苯甲醛(1.9%)、2-己烯醛(1.52%)、棕榈酸甲酯(3.41%)、异硫氰酸甲氧基甲酯(2.03%)、邻苯二甲酸正丁异辛酯(1.57%)、二氢猕猴桃内酯(1.41%)、棕榈酸(13.91%)。辣木茎中共鉴定出16种化合物,主要成分为苯甲醛(15.69%)、棕榈酸(9.47%)和亚油酸(7.91%)。辣木根中共鉴定出13种化合物,主要成分为苯乙腈(36.94%)、苯甲醛(18.21%)和异硫氰酸苄酯(15.96%)。